《遺傳生物鐘與代謝生物鐘偶在線上制的研究》是依託蘇州大學，由黃國存擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：遺傳生物鐘與代謝生物鐘偶在線上制的研究
- 項目類別：面上項目
- 項目負責人：黃國存
- 依託單位：蘇州大學
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
生物鐘是由基於轉錄和翻譯負反饋環路調控的遺傳振盪器和基於氧化還原變化的代謝振盪器組成。兩種振盪器共同作用使生物體內源生化過程與外界光暗環境同步化，但是不清楚二者是怎樣相互偶聯的。來自原核生物的Rex蛋白能夠結合NADH或NAD+,從而改變其轉錄活性。利用這一特性，我們在哺乳動物細胞中表達Rex蛋白，人工構建讓螢光素酶基因的轉錄表達受控於含有能夠與Rex蛋白特異結合的操作子序列。輸出的螢光化學信號間接反應了細胞體內的氧化還原代謝水平變化。是否細胞內源NADH/NAD+含量呈現24小時節律變化就會通過這種異源表達轉錄系統活體實時記錄下來。由於CLOCK:BMAL1能夠節律性的結合到其調控基因的E-Box區域，這樣就會進一步了解生物體內是還原條件還是氧化條件能夠促進生物鐘基因的轉錄表達，從而揭示遺傳振盪器和代謝振盪器的相互關係。
結題摘要
我們從不同菌株中克隆到三種Rex基因，發現兩種Rex基因在哺乳動物細胞中能夠感受NADH濃度的變化。利用螢光素酶做為報告基因發現NADH濃度變化呈現24小時節律性變化。輸出的螢光化學信號間接反應了細胞體內的氧化還原代謝水平變化。所以本研究發現了一種來自細菌的Rex蛋白可以感受哺乳動物細胞內NADH的濃度變化。這樣就會進一步了解生物體內是還原條件還是氧化條件能夠促進生物鐘基因的轉錄表達，從而揭示遺傳振盪器和代謝振盪器的相互關係。 課題另外一部分研究內容涉及生物鐘蛋白的翻譯後修飾。 蛋白質的翻譯後修飾包括磷酸化，泛素化，糖基化和乙醯化修飾等，生物鐘蛋白的不同修飾其功能也不盡相同，都有相關研究報導。有研究報導甲基化轉移酶EZH2在組蛋白的識別位點為RKS，中間的賴氨酸是EZH2的靶位點。我們發現CLOCK和BMAL1都含有EZH2的識別序列RKS，推測EZH2可能甲基化CLOCK（439K）和BMAL1（277K）。為此我們利用CRISPR/Cas9技術製作了CLOCK(K439A) 基因敲入小鼠。小鼠跑輪結果表明，野生型的周期大約23.75小時，突變體小鼠的周期變長大約24小時，雜合子小鼠周期介於其中。比較小鼠肝臟CLOCK和BMAL1蛋白水平，我們看到突變體明顯高於對照野生型小鼠，這和細胞瞬時表達的蛋白結果一致。以上結果表明CLOCK甲基化可能調控生物鐘的節律周期。
