達托黴素生物合成調控基因的鑑定和功能研究

《達托黴素生物合成調控基因的鑑定和功能研究》是依託西南大學，由廖國建擔任項目負責人的青年科學基金項目。

基本介紹

• 中文名：達托黴素生物合成調控基因的鑑定和功能研究
• 項目類別：青年科學基金項目
• 項目負責人：廖國建
• 依託單位：西南大學

項目摘要

耐藥病原菌所致感染嚴重威脅我國人群健康。達托黴素是治療革蘭氏陽性耐藥菌感染的重要藥物。達托黴素是玫瑰孢鏈黴菌產生的一種環脂肽類抗生素，其生物合成基因簇已被克隆，生物合成途徑已基本闡明，然而合成調控機制尚不明了。達托黴素基因簇中未發現合成調控基因，這與抗生素生物合成結構基因通常和調控基因連鎖在一起不同，表明其合成調控有獨特的機制。本項目將從靶向基因破壞基因簇下游調控基因和利用報導基因指引的轉座隨機突變文庫篩選兩方面來鑑定達托黴素生物合成調控基因。其次，通過基因破壞、遺傳互補和高表達研究等分子遺傳學手段來闡明調控基因的功能。另外，通過生物合成基因簇轉錄譜分析和凝膠阻滯等分子生物學手段初步揭示其調控的分子機制。本研究將為闡明達托黴素獨特的生物合成調控機制提供重要依據，而且對理性提高其產量有重要的理論指導意義。

結題摘要

達托黴素是治療革蘭氏陽性耐藥菌感染的重要藥物。本項目旨在揭示達托黴素生物合成調控的獨特機制，豐富非核糖體肽生物合成調控的機理，也為理性提高達托黴素產量提供理論指導。本項目取得了如下重要的成果： 1. 核糖體蛋白調控達托黴素生物合成的分子機理。鏈黴菌中，核糖體蛋白基因調控抗生素的生物合成，然而分子機理尚不明確。本研究採用“核糖體工程”方法，並結合基於報告基因的篩選方法獲得了兩個調控達托黴素生物合成的新的核糖體突變，分別是編碼核糖體蛋白S12的 rpsL （L43N）和編碼核糖體蛋白S3的rpsC（G152V），突變株中達托黴素產量分別提高2.2倍和1.8倍。通過定量蛋白質組（iTRAQ）比較野生型菌株和兩株高產株的蛋白表達差異，發現了有57個和24個蛋白在兩個高產突變株中表達量分別都發生了上調和下調。上調的蛋白包含大量核糖體蛋白，表明核糖體蛋白合成能力的增加可能是達托黴素高產的機制之一，下調的蛋白包含精氨酸和組氨酸代謝等胺基酸代謝基因，暗示胺基酸前體供應是調控達托黴素生物合成的重要途徑。過表達上調基因，如甘油激酶，核糖體循環因子和小中性蛋白調控蛋白都導致達托黴素產量的提高，該研究不僅發現了新型達托黴素生物合成調控基因，也表明定量蛋白質技術能夠用於發現抗生素生物合成調控蛋白。 2. 達托黴素生物合成前體相關基因調控達托黴素生物合成。癸酸和犬尿氨酸是合成達托黴素的兩個重要前體，本研究解析了犬尿氨酸的合成途徑和癸酸耐受的分子機理。通過控制犬尿氨酸合成途徑，過表達色氨酸2，3加氧酶tdo和dptJ後，產量分別增加了7%和112%。將犬尿氨酸酶kyn敲除後，產量增加了33.75%；玫瑰孢鏈黴菌癸酸耐受與細胞膜脂肪酸組成密切相關。支鏈脂肪酸是玫瑰孢鏈黴菌的主要脂肪酸，BCDH是其合成關鍵酶。鏈黴菌基因組有兩個編碼BCDH的基因簇，分別為bkd1和bkd2. Bkd1是支鏈脂肪酸合成的關鍵酶，其敲除株細胞膜中支鏈脂肪酸含量顯著降低，直鏈脂肪酸含量增加，突變株對癸酸更加敏感，並且喪失了達托黴素的合成能力，互補菌株恢復了支鏈脂肪酸含量和癸酸耐受能力。本項目發現了數個調控達托黴素生物合成的調控基因，初步揭示了達托黴素獨特和複雜的調控機制，此外，本研究採用的方法和思路也可供其他研究抗生素生物合成調控的研究者使用。