運用CMT2L轉基因小鼠模型進行CMT發病機理研究

《運用CMT2L轉基因小鼠模型進行CMT發病機理研究》是依託中南大學，由張如旭擔任項目負責人的面上項目。

基本介紹

• 中文名：運用CMT2L轉基因小鼠模型進行CMT發病機理研究
• 項目類別：面上項目
• 項目負責人：張如旭
• 依託單位：中南大學

項目摘要

腓骨肌萎縮症是一組最常見的周圍神經遺傳病，前期工作中我們運用微纖維技術構建人類野生HSPB8轉基因小鼠和K141N突變型HSPB8（CMT2L）轉基因小鼠模型，行為學、電生理和病理學鑑定表明突變型轉基因小鼠良好再現了CMT2L臨床表型，能有效用於HSPB8在CMT發病機理研究。本課題擬運用基因晶片技術檢測CMT2L轉基因小鼠在病程不同時期的基因表達水平變化；對表達改變的基因進行分子生物學功能分類和實時螢光定量PCR確認；運用免疫組化技術比較病程不同時期相應蛋白表達水平的變化，運用免疫螢光雙標技術在軸索/雪旺氏細胞進行蛋白定位，以期揭示HSPB8的分子功能和CMT2L內在發病機理，並為CMT治療提供靶點選擇；選擇表達水平改變顯著、且位於CMT亞型（致病基因尚未克隆）定位區間的基因為候選基因，在未明確基因診斷的CMT家系中進行突變分析，以期克隆新的CMT致病基因。

結題摘要

本課題以野生C57BL小鼠和wtHSPB8轉基因小鼠為對照，運用全基因組cDNA晶片技術檢測K141N HSPB8轉基因小鼠在病程不同時期（3,6,18月齡）的坐骨神經全基因組基因表達水平變化，找出6,18月齡K141N HSPB8轉基因小鼠的坐骨神經差異表達基因49個,其中上調的基因有31個，下調的基因有18個。蛋白相關聚類分析顯示有8個基因跟肌肉蛋白相關，分別為DES，MYOM1，MYLPF，MYH1，MYH4，NEB，PVALB和TPM2；6個基因跟動力蛋白結合有關，分別為MYH1，MYH4，NEB，NEXN，TPM2和XIRP2。通過功能相關聚類分析發現7個與肌肉收縮相關的基因，分別為DES，MYOM1，MYH1，MYH4，PGAM2，TCAP和TRDN；5個與碳水化合物合成相關基因，分別為FBP2，PGAM2，RBP4，PCK1和PPP1R3C。以野生C57BL小鼠和wtHSPB8轉基因小鼠為對照，經實時螢光定量PCR檢測在病程不同時期（3,6,18月齡）K141N HSPB8轉基因小鼠的坐骨神經上述基因轉錄水平差異，發現6,18月齡K141N HSPB8轉基因小鼠的坐骨神經碳水化合物合成相關基因FBP2，PCK1，RBP4，PGAM2，PPP1R3C表達上調,與晶片分析結果一致。以野生C57BL小鼠為對照，經免疫組化檢測發現FBP2，PCK1，RBP4蛋白在病程 6和18月齡的K141N HSPB8轉基因小鼠坐骨神經表達水平增加。以上結果確認碳水化合物合成相關基因在K141N HSPB8轉基因小鼠有表達上調，表明糖類代謝紊亂、線粒體能量產生異常和氧化應激可能參與CMT2L的發病機制。運用免疫螢光共定位和免疫電鏡雙標方法證實了在K141N HSPB8轉基因小鼠坐骨神經HSPB8與HSPB1和NEFL的存在共定位。收集65個CMT家系並完成常見基因（PMP22、CX32、MFN2和MPZ）分析，發現並報導了MPZ基因新突變2個；完成了3種不同的PMP22大片段重複檢測技術（CNV晶片、MLPA和限制性雙酶切）敏感性和特異性的比較分析，發現CNV晶片和MLPA特異性和敏感性顯著高於限制性雙酶切，而CNV晶片較MLPA更能提供全基因組和斷裂位點的具體信息；完成CX32基因突變患者臨床與電生理相關分析，發現CMT1X患者臨床殘疾進展與年齡、病程和CMAP明顯相關。