返魂草浸膏的質量檢測方法:專利背景,發明內容,專利目的,技術方案,有益效果,附圖說

《返魂草浸膏的質量檢測方法》是徐有章於2010年12月17日申請的專利，該專利的公布號為CN102539596A，授權公布日為2012年7月4日，發明人是徐有章、李艷茹、丁愛英。

《返魂草浸膏的質量檢測方法》該方法包括：（1）對照品溶液的製備；（2）供試品溶液的製備；（3）色譜條件：色譜柱以十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充劑；流動相為乙腈-0.4％磷酸溶液（7-9:91-93）的混合溶液；檢測波長為327納米；（4）測定：得到返魂草浸膏指紋圖譜。該發明還涉及返魂草浸膏的質量檢測方法及標準指紋圖譜。該發明的方法能有效表征返魂草浸膏的質量，有利於監控產品的質量；具有方法簡便、穩定性好、精密度高、重現性好的特點；可快速、準確地鑑別產品的真偽優劣。

2016年9月，《返魂草浸膏的質量檢測方法》獲得第二屆吉林省專利獎優秀獎。

（概述圖為《返魂草浸膏的質量檢測方法》摘要附圖）

基本介紹

中文名：返魂草浸膏的質量檢測方法
申請人：徐有章
申請日：2010年12月17日
申請號：2010106100645
公布號：CN102539596A
公布日：2012年7月4日
發明人：徐有章、李艷茹、丁愛英
地址：吉林省四平市開發區路3288號
Int.Cl.：G01N30/88(2006.01)I、A61K36/28(2006.01)I、A61P11/00(2006.01)I
代理機構：北京路浩智慧財產權代理有限公司
代理人：王加嶺、張慶敏
類別：發明專利

專利背景,發明內容,專利目的,技術方案,有益效果,附圖說明,權利要求,實施方式,榮譽表彰,

專利背景

中藥材返魂草主產於中國長白山，大小興安嶺等地。返魂草以地上全草入藥，具有清熱解毒、散血、消腫、下氣通經。用於瘀血脹痛、跌打損傷的功效。同時還具有抑菌作用，臨床用治療肺源性心臟病、慢性支氣管炎、急性肺感染，有顯著療效。另具有防治流感、潤肺、提高人體免疫力等功效。由於以返魂草為原料研製的新藥療效顯著，近幾年眾多製藥企業開始用其開發生產治療肺病新藥。

2010年前，返魂草還沒有作為法定藥材被國家藥品標準收錄，其質量指標也沒有法定標準。2010年前市售的產品肺寧顆粒、肺寧膠囊、肺寧片都是以返魂草為原料的治療呼吸道感染的純中藥製劑。通過檢測分析，該發明人發現，由於產地不同，或採摘季節不同，返魂草藥材內在質量存在很大的差異，僅以其中指標成分綠原酸的檢測結果為例，含量上的差異可達到十幾倍。綠原酸是返魂草藥材中一個重要的有效成分，而含量相差懸殊，會導致製劑的內在質量失去可控性，其臨床療效更是無法保證。這樣，勢必導致產品內在質量難以保證，無法達到臨床效果。中藥材質量的不可控性，是制約中國傳統中藥走向世界的一個難以解決的瓶頸問題。

當前世界很多國家和地區都很重視中藥的指紋圖譜的研究工作，中國台灣省已經對所有中成藥都實行指紋圖譜控制。國際上出現的標準植物藥製劑的概念，就是對製劑中的主要特性施行控制，制定標準的指紋圖譜，使植物藥由原料到成品都有穩定的標準，使質量更有保證。美國FDA對中國中藥市場的準入，一再的強調質量標準的提高，FDA要求中國的原料、半成品、製劑都要有相應的指紋圖譜。我們以返魂草浸膏為基礎，研究建立藥材提取物的指紋圖譜，正是順應了現代中藥發展潮流，力爭在未來的植物藥市場上保待一席之地。

到2010年前為止，在中藥生產和流通中，還沒有一種質量控制手段能夠全面地、綜合地反映出中藥產品的質量變異，可以有效地進行全過程的質量控制。通過對返魂草藥材浸膏的系統研究，證明採用高效液相色譜方法用指紋圖譜作為指控標準是可行的。從藥材的來源、生產、加工、貯存、中間品、成品、流通樣品等各個角度和方面，進行中藥樣品的理化分析，通過相似性和相關性對比，發現質量變異和缺陷，從而全面、特異地把握住以返魂草浸膏為主藥的系列產品例如肺寧系列產品的質量命脈。

發明內容

專利目的

《返魂草浸膏的質量檢測方法》的目的之一是提供返魂草浸膏HPLC指紋圖譜的構建方法，該發明的另一個目的是提供返魂草浸膏的質量檢測方法。

技術方案

《返魂草浸膏的質量檢測方法》包括以下步驟：

（1）對照品溶液的製備：精密稱取綠原酸、咖啡酸對照品，分別加入甲醇製成每1毫升含12-16微克的溶液，避光保存；

（2）供試品溶液的製備：取返魂草，加9-11倍量煎煮2-3次，每次1-2小時，合併煎液，濾過，濾液濃縮成浸膏、乾燥；取所得浸膏0.4-0.6克，置於50毫升容量瓶中，加甲醇35-45毫升，超聲處理30-60分鐘，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得，避光保存；

（3）色譜條件：色譜柱以十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充劑；流動相為乙腈-0.4％磷酸溶液為7-9:91-93的混合溶液；紫外檢測波長為327納米；流速為1.0毫升/分鐘；

（4）測定：精密吸取對照品溶液和供試品溶液各10微升，注入高效液相色譜儀，照高效液相色譜法測定，得到返魂草浸膏指紋圖譜。

優選地，步驟（1）所述對照品的濃度為每1毫升甲醇含15微克對照品。

優選地，步驟（2）所述供試品溶液的製備步驟如下：取返魂草，加水10倍量煎煮3次，第1次煎煮2小時，第2、3次每次煎煮1小時，合併煎液，濾過，濾液濃縮成浸膏、乾燥；取所得浸膏0.5克，置於50毫升容量瓶中，加甲醇40毫升，超聲處理45分鐘，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

優選地，步驟（3）所述流動相為乙腈-0.4％磷酸溶液為8:92的混合溶液。

該發明的另一個目的是提供返魂草浸膏的HPLC標準指紋圖譜的構建方法，按照前述方法構建12批返魂草浸膏HPLC指紋圖譜，採用中藥色譜指紋圖譜相似性評價系統軟體生成由6個共有峰構成的返魂草浸膏HPLC標準指紋圖譜，共有峰中第5號峰為綠原酸峰，第6號峰為咖啡酸峰。

在標準指紋圖譜中，以綠原酸峰為參照峰S峰，計算各特徵峰與S峰的相對保留時間，所述相對保留時間應在第一規定值的±5％之內，所述第一規定值分別為：0.12-峰1、0.16-峰2、0.24-峰3、0.49-峰4、1.00-峰S、1.27-峰6；所述共有峰的峰面積應在第二峰面積的規定值±20％之內，採用面積歸一化法計算，第二規定值分別為：9.91％-峰1、3.32％-峰2、3.27％-峰3、18.99％-峰4、36.28％-峰S、28.21％-峰6。

該發明的另一個目的是提供返魂草浸膏的質量檢測方法，該方法包括如下步驟：

（1）對照品溶液的製備：精密稱取綠原酸、咖啡酸對照品，分別加入甲醇製成每1毫升含12-16微克的溶液，避光保存；

（2）供試品溶液的製備：取返魂草，加水9-11倍量煎煮2-3次，每次1-2小時，合併煎液，濾過，濾液濃縮成浸膏、乾燥；取所得浸膏0.4-0.6克，置於50毫升容量瓶中，加甲醇35-45毫升，超聲處理30-60分鐘，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得，避光保存；

（4）測定：精密吸取對照品溶液和供試品溶液各10微升，注入高效液相色譜儀，照高效液相色譜法測定，得到返魂草浸膏指紋圖譜；

（5）取12批返魂草浸膏，按上述同法操作，構建12批返魂草浸膏HPLC指紋圖譜，採用中藥色譜指紋圖譜相似性評價系統軟體生成由6個共有峰構成的返魂草浸膏HPLC標準指紋圖譜，共有峰中第5號峰為綠原酸峰，第6號峰為咖啡酸峰；

在標準指紋圖譜中，以綠原酸峰為參照峰S峰，計算各特徵峰與S峰的相對保留時間，所述相對保留時間在第一規定值的±5％之內，所述第一規定值為：0.12-峰1、0.16-峰2、0.24-峰3、0.49-峰4、1.00-峰S、1.27-峰6；所述共有峰的峰面積在第二規定值±20％之內，採用面積歸一化法計算，第二規定值分別為：9.91％-峰1、3.32％-峰2、3.27％-峰3、18.99％-峰4、36.28％-峰S、28.21％-峰6；

（6）取返魂草浸膏樣品，按上述同法操作，得到返魂草浸膏樣品指紋圖譜，採用中藥色譜指紋圖譜相似性評價系統軟體對返魂草浸膏的標準指紋圖譜和樣品指紋圖譜進行分析，相似度大於0.95為合格產品。

優選地，步驟（1）所述對照品的濃度為每1毫升甲醇含15微克對照品。

優選地，步驟（3）所述流動相為乙腈-0.4％磷酸溶液為8:92的混合溶液。

在一個優選的實施方案中，返魂草HPLC標準指紋圖譜中各共有峰的保留時間和峰面積如表1所示：

表1返魂草HPLC標準指紋圖譜中共有峰的保留時間和峰面積

峰號	保留時間RT （分鐘）	RSD （%）	峰面積（A）	RSD （%）
1號峰	2.54	0.91	152999	2.69
2號峰	3.19	0.72	59692	3.11
3號峰	4.95	1.57	72272	2.57
4號峰	9.98	0.92	322837	1.82
5號峰	20.51	0.37	495408	1.13
6號峰	26.01	0.46	385225	1.24

有益效果

《返魂草浸膏的質量檢測方法》的有益效果如下：

（1）該發明的方法以綠原酸和咖啡酸為對照品，建立的返魂草HPLC標準指紋圖譜能有效、準確地表征返魂草浸膏的質量，有利於全面監控產品的質量，為藥品的質量檢測提供可靠的依據。

（2）返魂草的指紋圖譜注重各個構成指紋特徵峰的前後順序和相互關係，注重整體面貌特徵。

（3）該發明的質量檢測方法能有效地監控返魂草浸膏的質量，保證其質量的穩定、均一、可控。具有方法簡便，穩定性好、精密度高、重現性好等優點，可快速、準確地鑑別產品的真偽優劣。

附圖說明

圖1為返魂草浸膏的HPLC指紋圖譜；

圖2為返魂草浸膏的12批次原始指紋圖譜；

圖3為返魂草浸膏的標準指紋圖譜。

權利要求

1.返魂草浸膏HPLC指紋圖譜的構建方法，包括以下步驟：

（1）對照品溶液的製備：精密稱取綠原酸、咖啡酸對照品，分別加入甲醇製成每1毫升含12-16微克的溶液；

（2）供試品溶液的製備：取返魂草，加水9-11倍量煎煮2-3次，每次1-2小時，合併煎液，濾過，濾液濃縮成浸膏、乾燥；取所得浸膏0.4-0.6克，置於50毫升容量瓶中，加甲醇35-45毫升，超聲處理30-60分鐘，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得；

（4）測定：精密吸取對照品溶液和供試品溶液各10微升，注入高效液相色譜儀，照高效液相色譜法測定，得到返魂草浸膏指紋圖譜。

2.根據權利要求1所述的方法，所述對照品的濃度為每1毫升甲醇含15微克對照品。

3.根據權利要求1所述的方法，所述供試品溶液的製備步驟如下：取返魂草，加水10倍量煎煮3次，第1次煎煮2小時，第2、3次每次煎煮1小時，合併煎液，濾過，濾液濃縮成浸膏、乾燥；取所得浸膏0.5克，置於50毫升容量瓶中，加甲醇40毫升，超聲處理45分鐘，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

4.根據權利要求1所述的方法，所述流動相為乙腈-0.4％磷酸溶液為8:92的混合溶液。

5.返魂草浸膏的HPLC標準指紋圖譜的構建方法，其特徵在於，按照權利要求1-4任一項所述的方法構建12批返魂草浸膏HPLC指紋圖譜，採用中藥色譜指紋圖譜相似性評價系統軟體生成由6個共有峰構成的返魂草浸膏HPLC標準指紋圖譜，所述共有峰中第5號峰為綠原酸峰，第6號峰為咖啡酸峰。

6.根據權利要求5所述的方法，其特徵在於，所述標準指紋圖譜中，以綠原酸峰為參照峰S峰，計算各特徵峰與S峰的相對保留時間，所述相對保留時間在第一規定值的±5％之內，所述第一規定值分別為：0.12-峰1、0.16-峰2、0.24-峰3、0.49-峰4、1.00-峰S、1.27-峰6；所述共有峰的峰面積在第二規定值±20％之內，採用面積歸一化法計算，第二規定值分別為：9.91％-峰1、3.32％-峰2、3.27％-峰3、18.99％-峰4、36.28％-峰S、28.21％-峰6。

7.根據權利要求6所述的方法，其特徵在於，所述6個共有峰的保留時間分別為2.54、3.19、4.95、9.98、20.51、26.01，峰面積分別為152999、59692、72272、322837、495408、385225。

8.返魂草浸膏的質量檢測方法，其特徵在於，取返魂草浸膏樣品，按權利要求1-4任一項同法操作，得到返魂草浸膏樣品指紋圖譜，採用中藥色譜指紋圖譜相似性評價系統軟體對所述樣品指紋圖譜和權利要求5-7任一項所述的返魂草浸膏的標準指紋圖譜進行分析，相似度大於0.95為合格產品。

實施方式

實施例1構建返魂草浸膏的HPLC指紋圖譜

1.儀器、試藥

1.1儀器：島津LC-2010AHT高效液相色譜儀（四元泵、線上脫氣機、柱溫箱（柱溫28℃）、自動進樣器、UVD檢測器）；BS210S電子天平；色譜柱：AgilentZORBAXSB-C₁₈（5微米，4.6×250毫米）。

1.2試藥：綠原酸對照品、咖啡酸對照品（中國藥品生物製品鑑定所提供）。液相色譜分析用試劑為色譜純，其餘試劑均為分析純，水為超純水。

2.高效液相色譜

2.1對照品溶液的製備：精密稱取綠原酸、咖啡酸對照品適量，精密稱定，加甲醇製成每1毫升分別含15微克的溶液，即得（避光保存）。

2.2供試品溶液的製備：取返魂草100克，加水10倍量煎煮三次，第一次2小時，第二、三次各1小時，合併煎液，濾過，濾液濃縮成膏。取製得的浸膏0.5克，精密稱定，至50毫升量瓶中，加甲醇40毫升，超聲處理（功率300瓦，頻率25千赫）45分鐘，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得（避光保存）。

2.3色譜條件：色譜柱以十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充劑；流動相為乙腈-0.4％磷酸溶液（8:92）的混合溶液；紫外檢測波長為327納米；流速為1.0毫升/分鐘。理論板數按綠原酸峰計算應不低於3000。

2.4測定：精密吸取對照品溶液和供試品溶液各10微升，注入高效液相色譜儀，照高效液相色譜法測定，得到指紋圖譜，如圖1所示。

實施例2構建返魂草浸膏的HPLC標準指紋圖譜

取返魂草浸膏12批次（分別來自長白山藥材所3批、黑龍江藥材所2批、吉林四平藥材所3批、遼寧藥材所2批、內蒙古藥材所2批），按實施例1條件進行檢測，得12批次樣品的HPLC圖譜，如圖2所示。通過12批HPLC圖譜的比較，採用中國藥典委員會推薦的《中藥色譜指紋圖譜相似性評價系統》軟體對HPLC圖譜進行相似度評價，確定共有特徵峰，得到返魂草的標準指紋圖譜。

在標準指紋圖譜中，返魂草浸膏的指紋圖譜中含有6個共有特徵峰，其中參照峰為綠原酸（5號峰）和咖啡酸（6號峰）。

相似度評價：以《中藥色譜指紋圖譜相似性評價系統》軟體分析，計算供試品指紋圖譜與標準指紋圖譜的相似度，結果均大於0.95。相似度評價結果見表2。

表2HPLC指紋圖譜相似度評價

批次	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
相似度	0.984	0.975	0.976	0.975	0.990	0.988	0.982	0.981	0.998	0.984	0.997	0.978

通過上述方法所建立的返魂草浸膏HPLC的標準指紋圖譜如圖3所示。

實施例3返魂草浸膏的質量檢測方法

取20批返魂草浸膏樣品（長白山一年生家種藥材、長白山野生藥材、黑龍江大興安嶺野生藥材、吉林四平野生藥材、內蒙古野生藥材各四批，均在8月份採摘，曬乾），按實施例1的條件同法操作，得到返魂草浸膏樣品指紋圖譜，採用中藥色譜指紋圖譜相似性評價系統軟體對返魂草浸膏的標準指紋圖譜和樣品指紋圖譜進行分析，相似度大於0.95為合格產品。

檢測結果表明，長白山野生藥材、黑龍江大興安嶺野生藥材、吉林四平野生藥材、內蒙古野生藥材均在8月份採摘，曬乾的藥材樣品為合格樣品，批次編號分別為005--020；長白山一年生家種藥材為不合格樣品，批次編號為001-004。

綜上所述，該發明質量檢測方法的穩定性好、重複性好，因此，該發明的技術方案具有可行性。利用該發明質量檢測方法監控獲得的該發明的中藥製劑，藥效確切，作用穩定。以下利用實驗例具體說明。

實驗例1藥理學實驗

取合格批次返魂草浸膏樣品，進行藥理學實驗，批次編號為20091001，結果表明該品具有如下的藥理作用：

1.1抑菌作用及其機制

返魂草提取物有明顯制炎症反應的作用，與體外抗菌作用相符。通過體外抑菌圈試驗及利用色譜技術分離純化，得到5個具有抗菌活性的化合物：5-羥基吡啶-2-甲酸甲酯、6羥基7、7a-二氫-2-（6H）-苯駢呋喃酮、2-（1，4-二羥基環己基）-乙酸、3-羥基環己酸、4-羥基苯甲醛。三個抗菌糖苷類：苄基-O-α-L-吡喃阿拉伯糖基（1-7b）β-D-吡喃葡萄糖苷、（6S，9S）-6羥基-3-酮-α-紫羅蘭醇-3-酮-9-O-β-D-葡糖苷、（6S，9R）-6羥基-3-酮-α-紫羅蘭醇-3-酮-9-O-β-D葡糖苷。返魂草的水煎液對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的作用比較明顯，而其醇提液對綠膿桿菌、沙門氏菌和白色葡萄球菌的抑制作用均大於其水煎液，對鏈球菌的作用兩者抑菌效果相當。返魂草的主要成分是酚酸類，從其中分得到三個結晶，分別鑑定為氫醌、對羥基苯乙酸、熊果苷，其作用是抑菌而非殺菌，對細菌的呼吸及DNA和蛋白質的合成都有抑制作用，從而呈現出抑菌效果。

1.2抗病毒作用

返魂草對病毒引起的感染性疾病有很好的療效：引起皰疹單純角膜炎的皰疹病毒能夠在一定程度上被其抑制；雞胚實驗證明，該藥物2.5毫克/千克胚對FM1型流感病毒具有明顯的抑制作用，促進新雞瘟病毒誘導人全血細胞產生干擾素；給小鼠腹腔注射該不同劑量藥物時，對鼻腔注射甲I型（FM1）鼠肺適應株流感病毒的小鼠具有保護作用，降低感染流感病毒小鼠的肺指數；對MDCK細胞具有離體抗感染病毒的作用其提取物咖啡酸和綠原酸對呼吸道合胞病毒、腺病毒感染的也具有一定的抑制作用。

1.3對免疫功能的抑制

寬葉返魂草水煎劑可使小鼠脾臟萎縮及其B淋巴細胞轉化率下降，表明寬葉返魂草有抑制體液免疫應答的作用；碳廓清實驗的結果顯示，寬葉返魂草使小鼠碳廓清指數明顯降低，表明該藥對非特異性巨噬細胞吞噬功能亦有抑制作用；寬葉返魂草使小鼠胸腺萎縮，使脾臟T淋巴細胞轉化率輕度下降，使脾細胞產生的IL-2輕度減少，說明寬葉返魂草對細胞免疫應答抑制不明顯。以上證明寬葉返魂草對機體免疫功能具有一定調節作用。

1.4抗炎、解熱、鎮痛

1.4.1炎症的產生機制

一些致炎物質引起的以局部滲出、水腫為特徵的急性炎症反應。當局部受到致病因子的刺激後，局部血管擴張，巨噬細胞、中性粒細胞聚集到炎症部位，釋放炎性因子和水解酶類，如前列腺素、白三烯、緩激肽等，導致局部的炎症反應。返魂草提取物對二甲苯致小鼠耳腫脹、1％角叉菜膠致大鼠足趾腫脹、大鼠棉球肉芽腫都有明顯抑制作用。

1.4.2機體的發熱反應

機體的發熱反應是由於外原性致熱物質如細菌、病毒、毒素及抗原抗體複合物等，刺激中性粒細胞釋放內熱源如IL-lp、IL-6、IFN-a、IFN-b和TNF-a等細胞因子，這些細胞因子又促使下丘腦視前區附近合成PGEZ，通過cAMP觸發下丘腦的體溫調解中樞增加產熱，使體溫升高。返魂草提取物能明顯抑制內毒素致家兔體溫升高和啤酒酵母致大鼠發熱反應，作用強度與劑量呈一定相關性。

1.4.3疼痛的產生機制

疼痛的產生機制是局部組織損傷或發炎時，產生或釋放止痛物質如緩激肽等，作用於感覺神經末梢引起疼痛，同時也產生與釋放前列腺素P增加前者等致痛物質的敏感性，不但有致炎致痛作用，還能將其放大；感覺神經末稍受到刺激後釋放谷氨酸、神經肽類等傷害性遞質，沿感覺神經傳入中樞神經。前者是解熱、鎮痛、抗炎藥的作用部位，後者是阿片類鎮痛藥的作用部位。返魂草提取物具有顯著提高小鼠熱板法、小鼠光熱輻射法疼痛反應的閾值，鎮痛作用確定，作用呈量效關係。

實驗例2臨床療效驗證

試驗製劑

取合格批次返魂草浸膏樣品（批次為20091001），製成膠囊（取返魂草浸膏加澱粉適量，乾燥，粉碎，裝入膠囊即得。1克生藥/粒），對300例臨床患者口服給藥。用法與用量：口服，一次4粒，一日3次，1個月為一個療程。以芩暴紅止咳片為對照藥，薄膜衣每片重0.4克，對100例臨床患者口服給藥，一次3～4片，一日3次。

試驗對象

臨床研究採用多中心、隨機、單盲、平行對照的方法。治療組與對照組的比例為3:1，在3家醫院同時進行，受試病例數治療組和對照組分別為300例和100例。觀察單位及病例分配數見表3：

表3臨床研究單位病例分配方法

臨床研究參加單位	試驗病例數（治療組：對照組）	治療前後檢查的項目
臨床研究參加單位	試驗病例數（治療組：對照組）	血常規	胸部X線
吉林省醫院	100:40	√	√
長春市人民醫院	100:30	√	√
吉林大學第四附屬醫院	100:30	√	√
總計	400	/	/