《豬圓環病毒Ⅱ型疫苗及其生產方法》是洛陽普萊柯生物工程有限公司於2010年9月3日申請的發明專利，該專利的申請號為2010102750752，公布號為CN101934074A，公布日為2011年1月5日，發明人是張許科、孫進忠、喬榮岑，該專利屬於生物製品技術領域。
《豬圓環病毒Ⅱ型疫苗及其生產方法》包括如下技術步驟：（1）制苗用細胞高密度培養；（2）制苗毒液的繁殖；（3）加入佐劑製備滅活疫苗。與2010年9月前已有技術相比，該發明具有病毒產量高、毒價高、生產規模大、單批次產量高、生產成本相對較低、產品質量高且穩定等優點。該發明滅活疫苗具有較好安全性，並可以誘導豬體產生免疫保護效果，完全符合國家獸醫生物製品標準。
2014年11月6日，《豬圓環病毒Ⅱ型疫苗及其生產方法》獲得第十六屆中國專利優秀獎。
（概述圖為《豬圓環病毒Ⅱ型疫苗及其生產方法》摘要附圖）
基本介紹
- 中文名：豬圓環病毒Ⅱ型疫苗及其生產方法
- 公布號：CN101934074A
- 公布日：2011年1月5日
- 申請號：2010102750752
- 申請日：2010年9月3日
- 申請人：洛陽普萊柯生物工程有限公司
- 地址：河南省洛陽市洛龍區政和路15號
- 發明人：張許科、孫進忠、喬榮岑
- 分類號：A61K39/12（2006.01)I、C12N7/00（2006.01)I、A61P31/20（2006.01)I、C12R1/93（2006.01)N
- 代理機構：北京華夏正合智慧財產權代理事務所（普通合夥）
- 類別：發明專利
- 代理人：韓登營
專利背景,發明內容,技術方案,改善效果,附圖說明,權利要求,實施方式,實施案例,榮譽表彰,
專利背景
豬圓環病毒Ⅱ型（簡稱PCV2）感染引起的斷奶仔豬多系統衰竭綜合徵（PMWS）、豬呼吸疾病綜合徵（PRDC）、豬皮膚和腎病綜合徵（PDNS）等多種疾病（總稱為豬圓環病毒病，PCVDs），其臨床特徵為體重逐漸減輕，以及體徵例如呼吸急促、呼吸困難和黃疸。從病理學觀點來看，其表現為淋巴細胞或肉芽腫浸潤，淋巴結病以及較罕見的肝炎和淋巴細胞或肉芽腫性腎炎。（ClarkE.G.（1997）Proc.Am.Assoc.SwineP rac.499-501；La Semaine Veterinaire No.26，supplement to La Semaine Veterinaire1996（834）；La Semaine Veterinaire1997（857）：54；Nayar等人（1997）Can.V et.J.38：385-387）。該病最早於1991年在加拿大西部發現（Clark EG.Post-weaning multisystemic wasting syndrome.Proc Am AssocS wine Pract，1997，28：499-501），隨後，該疾病相繼在美國、法國、西班牙、北愛爾蘭等國或地區出現（Daft B等.Interstitial pneumonia and lymphadenophathy associated with circoviral infection in a sixweek-old pig.Proc Am Assoc Yet Lab Diag，1996，39：32；Kennedy S等.Porcine circovirus infection in Northern Ireland.vet Rec，1998，142：495並96；LeCann P等.Piglet wasting disease.Tlet Rec，1997，141：660；SegalesJ等.First report of post-weaning multisystemic wasting syndrome in pigs in Spain.Vet Rec，1997，141：600-660）。在中國國內，郎洪武等（郎洪武等.斷奶豬多系統衰弱綜合徵血清抗體檢測.中國獸醫科技，2000，30：3-5）和曹勝波等（曹勝波等.豬Ⅱ型圓環病毒豫A株的全基因組克隆與序列分析.病毒學報，2000，18：137-141）分別通過血清學和病原學調查表明，中國已有PCV2的流行。2010年9月前，PCV2已在世界各地廣泛存在並流行，給全球養豬業造成了相當大的經濟損失。
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2010年9月前，還沒有治療和預防這種疾病的方法。然而，多項證據指出豬圓環病毒是PMWS（斷奶仔豬多系統衰竭綜合徵）的病原體（Ellis等人（1998）Can.V et.J.39：44-51）。圓環病毒已從患有PMWS的豬回收，並且針對豬圓環病毒的抗體已在患有該疾病的豬體內證實。由於該病毒是一種DNA病毒，病毒變異率低，同時在世界範圍內的致病只有PCV2一型。而PCV2的生物學特性比較特殊，它在細胞上增殖滴度很低，而且不引起細胞病變，因此研製PCV2的滅活疫苗和弱毒疫苗的難度很大。
2010年9月前，中國國內外生產疫苗主要有兩種工藝：（1）生物反應器：規模較小，一般是實驗室用，不能規模化生產；其有攪拌漿，以載體為依託培養細胞。這種方法的缺點是：攪拌產生剪下力，並且有氣泡生成，影響細胞生長，規模化生產存在技術瓶頸。（2）轉瓶技術：工業化生產基本都採用這種技術，生產細胞和病毒時勞動強度大、占地大、批間差異大、生產成本高、單批產量低，難以進行標準化生產的質量控制。
截至2010年9月，在中國還未有確實有效並經過農業部批准的PCV2疫苗，主要原因還在於，PCV2在細胞中的生長滴度較低，一般僅為10TCID50/毫升左右。因此提高病毒毒價，保證良好的臨床效果是解決豬圓環病毒Ⅱ型疫苗產業化的當務之急。
發明內容
技術方案
《豬圓環病毒Ⅱ型疫苗及其生產方法》包括如下步驟：
1）微載體生物反應器中，微載體密度為60～80克/升，每克載體加入1.4×10～2.6×10個傳代細胞及細胞生長液，啟動細胞吸附程式使微載體與傳代細胞充分結合後，啟動細胞培養程式，培養傳代細胞；
2）上述傳代細胞培養至5.0×10cells/升～8×10cells/升時換用細胞維持液，按照感染複數為M.O.I.＝0.001～1接種豬圓環病毒Ⅱ型，啟動病毒吸附程式，使病毒與傳代細胞充分接觸，換用病毒培養程式，擴增培養豬圓環病毒Ⅱ型；
3）病毒培養24～36小時後，棄去細胞維持液，用緩衝溶液沖洗傳代細胞，加入孵育劑孵育30～45分鐘，棄去孵育劑，用緩衝溶液沖洗傳代細胞，加入細胞維持液繼續培養；
4）收穫培養液，經細胞破碎處理，獲得豬圓環病毒Ⅱ型病毒液。
5）病毒液加入滅活劑，滅活後加入佐劑、乳化劑，製得豬圓環病毒Ⅱ型疫苗。
優選地，該發明所述的生物反應器為微載體懸浮培養生物反應器。更優選地，該發明所述的生物反應器為潮汐式微載體懸浮培養生物反應器。
優選地，該發明所述的微載體為球形、網狀或片狀微載體。更優選地，該發明所述的微載體為聚酯、明膠或多糖。
優選地，該發明所述方法步驟2）中所述細胞生長液為含3％～10％牛血清的DMEM培養基。更優選地，該發明所述的牛血清的含量為5％～7％最優選地，該發明所述的牛血清的含量為6％
優選地，該發明所述的細胞維持液為含1％～5％牛血清的DMEM培養基。更優選地，該發明所述的牛血清的含量為2％～3％最優選地，該發明所述的牛血清的含量為2％
優選地，該發明所述的孵育劑為D-氨基葡萄糖、干擾素或脂多糖。更優選地，該發明所述的孵育劑為D-氨基葡萄糖。
優選地，該發明所述生物反應器中的培養條件為溫度37℃，CO2濃度為5％，培養液pH值為7.0～7.6。
優選地，該發明所述方法步驟4）中所述豬圓環病毒Ⅱ型病毒液的體積為2.5升～1000升。
該發明的另一方面為使用該發明方法製備的豬圓環病毒Ⅱ型病毒液。
該發明的又一方面為使用該發明方法製備的豬圓環病毒Ⅱ型疫苗。
改善效果
與2010年9月前已有技術相比，該發明的豬圓環病毒Ⅱ型疫苗的生產方法，具有以下有益效果：
（1）毒價高：傳統的轉瓶工藝生產的PCV2病毒毒價僅為10TCID50/毫升，而該發明採用新的技術參數，運用潮汐式微載體懸浮培養技術高密度培養生產的病毒毒價可以達到10TCID50/毫升～10TCID50/毫升，其毒價要高出100-1000倍。
（2）生產規模大、單批次產量高：2010年9月前中國國內採用攪拌式懸浮培養工藝培養動物細胞，單台生物反應器最大規模不超過100升；而該發明採用新的技術參數，運用潮汐式微載體懸浮培養技術培養動物細胞，單台生物反應器規模達500升，最大可達1000升，單台規模提高5-10倍。
（3）連續式封閉式生產、收穫病毒：該發明的方法可以全封閉生產，自動換液，連續收穫方式收集病毒液，減少了污染的機率，產品質量均一穩定，批間差異小。解決了傳統工藝僅能控制溫度和轉速，不同批次質量差異大、批間差異大的問題。該發明方法，可直接線性放大用於生產。
（4）生產成本相對較低、產品質量高且穩定：傳統轉瓶生產工藝生產的PCV2病毒毒價僅為10TCID50/毫升，要達到獸用生物製品規程要求的10TCID50/毫升，需要進行濃縮處理，每毫升的生產成本為3元，而該發明工藝生產的PCV2病毒毒價平均可達10TCID50/毫升，每毫升的生產成本為0.5元，產品成本下降6倍，質量提高提高100倍（以毒價計）。不同培養系統增殖豬圓環病毒比較結果見表1。
培養方式 | 懸浮培養 | 3000毫升轉瓶培養系統 |
細胞貼壁面積 | 3840000平方厘米 | 1250平方厘米 |
產量比值 | 1個微載體培養系統 | 3072個轉瓶 |
占地面積 | 20平方米 | 700平方米 |
人工投入 | 2個人×4小時 | 130個人×10小時 |
風險暴露點 | <20個 | 3072個 |
耗材成本 | 低 | 高 |
清洗成本 | 低 | 高 |
收穫病毒液 | 500升 | 3072x300毫升=921.6升 |
病毒毒價 | 10TCID50/毫升 | 10TCID50/毫升 |
操作工藝 | 全自動微電腦控制 | 程式繁瑣 |
備註：載體貼壁面積1克＝2400平方厘米，1個微載體懸浮培養系統加入載體的量按1600克計算。
附圖說明
圖1為細胞接種0天時微載體上的顯微照片；
圖2為病毒接種5天時微載體上的顯微照片；
圖3為病毒接種10天時微載體上的顯微照片；
圖4為潮汐式微載體懸浮培養生物反應器結構示意圖。
權利要求
1.《豬圓環病毒Ⅱ型疫苗及其生產方法》其特徵在於，包括如下步驟：
1）微載體生物反應器中，微載體密度為60～80克/升，每克載體加入1.4×10～2.6×10個傳代細胞及細胞生長液，啟動細胞吸附程式使微載體與傳代細胞充分結合後，啟動細胞培養程式，培養傳代細胞；
2）上述傳代細胞培養至5.0×10cells/升～8.0×10cells/升時換用細胞維持液，按照感染複數為M.O.I.＝0.001～1接種豬圓環病毒Ⅱ型，啟動病毒吸附程式，使病毒與傳代細胞充分接觸，換用病毒培養程式，擴增培養豬圓環病毒Ⅱ型；
3）病毒培養24～36小時後，棄去細胞維持液，用緩衝溶液沖洗傳代細胞，加入孵育劑孵育30～45分鐘，棄去孵育劑，用緩衝溶液沖洗傳代細胞，加入細胞維持液繼續培養；
4）收穫培養液，經細胞破碎處理，獲得豬圓環病毒Ⅱ型病毒液；
5）病毒液加入滅活劑，滅活後加入佐劑、乳化劑，製得豬圓環病毒Ⅱ型疫苗。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述生物反應器為微載體懸浮培養生物反應器。
3.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述生物反應器為為潮汐式微載體懸浮培養生物反應器。
4.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述微載體為球形、網狀或片狀微載體。
5.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述微載體為聚酯、明膠或多糖。
6.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟2）中所述細胞生長液為含3％～10％牛血清的DMEM培養基。
7.根據權利要求6所述的方法，其特徵在於，所述牛血清的含量為5％～7％。
8.根據權利要求6所述的方法，其特徵在於，所述牛血清的含量為6％。
9.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟3）中所述細胞維持液為含1％～5％牛血清的DMEM培養基。
10.根據權利要求9所述的方法，其特徵在於，所述的牛血清的含量為2％～3％。
11.根據權利要求9所述的方法，其特徵在於，所述的牛血清的含量為2％。
12.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟3）中所述的孵育劑為D-氨基葡萄糖、干擾素或脂多糖。
13.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述微載體懸浮培養生物反應器的培養條件為溫度37℃，CO2濃度為5％，培養液pH值為7.0～7.6。
14.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於：步驟4）中所述豬圓環病毒Ⅱ型病毒液的體積為2.5升～1000升。
15.一種由權利要求1-14任意一項方法製備的豬圓環病毒Ⅱ型病毒液。
16.一種由權利要求1-14任意一項方法製備的豬圓環病毒Ⅱ型疫苗。
實施方式
實施例中使用了潮汐式微載體懸浮培養生物反應器，其他類型的微載體懸浮培養生物反應器，如：攪拌式、旋轉式或灌注式微載體懸浮培養生物反應器，均可以使用該發明之方法大規模生產PCV2病毒或疫苗。優選地，該發明使用潮汐式微載體懸浮培養生物反應器，可以提高培養時的培養基和溶解氧的供應，無氣泡並且剪下力小，對細胞傷害小。
《豬圓環病毒Ⅱ型疫苗及其生產方法》實施例中採用的生物反應器為潮汐式生物反應器。結構示意圖如圖4所示。其中，各個標記分別為：恆溫攪拌系統1，培養基恆溫備料槽體2，自動饋料系統3，恆溫培養箱4，傳代細胞5，微載體6，DO檢測器及pH控制器7，收集器8。較優地，該發明實施例中採用了依據潮汐原理而設計的潮汐式生物反應器系統，培養系統分為兩部份；一個是載體瓶，另一個是培養基攪拌袋（槽）。細胞固定在載體瓶，培養基流動於載體瓶與攪拌槽之間，造成間歇性的暴露與淹沒載體。在該發明實施例中，所用反應器的載體瓶體積為5升、10升、20升、50升、100升，均能對溫度、pH值、溶解氧、二氧化碳濃度自動控制。
該發明實施例中，傳代細胞使用了PK15，其他該領域常用的傳代細胞如PKK細胞（PK15克隆細胞）、RK細胞（兔腎細胞）、Vero細胞（非洲綠猴腎細胞）、ST細胞（豬睪丸細胞）、Dulac細胞（豬腎細胞），也可用於該發明之方法大規模生產PCV2病毒或疫苗。
該發明所述方法中，在細胞吸附微載體階段與細胞培養階段，啟動了細胞吸附程式與細胞培養程式，該發明實施例中最佳化了反應器的控制參數，但該發明方法不僅限於實施例中的參數，該領域技術人員可以根據該發明提供的技術啟示，根據不同的生物反應器，調整相應的參數，達到微載體與細胞充分結合後，大量擴增細胞的目的。
該發明所述方法中，在病毒吸附微載體階段與病毒培養階段，啟動了病毒吸附程式與病毒培養程式，該發明實施例中最佳化了反應器的控制參數，但該發明方法不僅限於實施例中的參數，該領域技術人員可以根據該發明提供的技術啟示，根據不同的生物反應器，調整相應的參數，達到病毒與細胞及微載體充分結合後，大量擴增病毒的目的。
該發明實施例中，使用了孵育劑為D-氨基葡萄糖，其他類型的孵育劑，如IFN（干擾素）、LPS（脂多糖），也可用於病毒收穫前的孵育。
該發明試驗了微載體密度為60～80克/升，每克微載體加入1.4×102.6×10cells的傳代細胞，更優地，該發明實施例中使用的微載體密度為80克/升，細胞密度為2.0×10cells/克微載體。
該發明試驗了當傳代細胞的密度達到5.0×10cells/升～8.0×10cells/升時，即密度達到初始密度的5～40倍時，換用細胞維持液，起始病毒吸附與培養程式為佳。
該發明試驗了按照感染複數為M.O.I.＝0.001～1接種PCV2，收穫的豬圓環病毒Ⅱ型毒價最高，優選地，該發明實施例中使用了M.O.I.＝0.1接種病毒，啟動病毒吸附程式與病毒培養程式，擴增豬圓環病毒Ⅱ型。
該發明細胞生長液使用了含3％～10％牛血清的DMEM培養基；更優選地，該發明使用了牛血清的含量為5％～7％；最優選地，該發明實施例中使用的DMEM培養基的牛血清的含量為6％
該發明細胞維持液使用了含1％～5％牛血清的DMEM培養基；更優選地，該發明使用了牛血清的含量為2％～3％；最優選地，該發明實施例中選用了牛血清的含量為2％的DMEM培養基。
該發明試驗了病毒培養時間為24～36小時後，棄去細胞維持液，用緩衝溶液沖洗傳代細胞；優選地，該發明實施例中使用了24小時的病毒培養時間，用PBS沖洗傳代細胞。
該發明試驗了孵育劑的孵育時間為30～45分鐘，優選地，該發明實施例中孵育時間為30分鐘。
該發明沖洗傳代細胞的緩衝溶液為常規PBS，優選地，該發明實施例使用了0.01摩爾/升的PBS緩衝液。優選地，該發明實施例中採用反覆凍融的方法，使細胞完全脫落、分散，從而獲得病毒液。該發明還可使用其他該領域常用的破碎細胞的方法，獲得病毒液。
該發明實施例中疫苗的製備方法為加入甲醛滅活劑，滅活後加入油性佐劑、乳化劑，製得豬圓環病毒Ⅱ型疫苗。其他常用的滅活方法或滅活劑，如β-丙內脂、二甲亞胺，也可用於製備該發明所述疫苗。該領域其他常用的疫苗製備的佐劑，如白油、其他水性佐劑等，也可用於製備該發明所述疫苗。
該發明實施例方法包括下列操作步驟：
（1）將制苗用宿主細胞接種到含有細胞生長用培養液與微載體的載體罐內，並將上述細胞與微載體混合均勻，使細胞貼附在微載體上；在適當培養環境下，提供上述細胞生長足夠的養分及氣體環境，使細胞在上述微載體上生長至接種濃度的5～40倍；
（2）將細胞生長液更換為維持用培養液，並同步加入豬圓環病毒Ⅱ型種毒，先使其吸附在細胞上，然後進行培養，增殖病毒；
（3）培養24小時後將細胞維持液棄去，接種病毒的細胞用0.01摩爾/升的PBS充分洗滌，加入D-氨基葡萄糖孵育30分鐘；
（4）棄去D-氨基葡萄糖，將細胞用0.01摩爾/升的PBS（pH7.4）充分洗滌，加入細胞維持液繼續培養細胞；
（5）連續培養10天后，收穫病毒液，於-20℃冷凍，20℃融解，反覆兩次，得到豬圓環病毒Ⅱ型（PCV2）病毒液；
（6）病毒液經檢驗合格後，加入甲醛滅活，滅活後的豬圓環病毒Ⅱ型（PCV2）加入常規油性佐劑或雙相佐劑，攪拌混勻，製得油乳劑疫苗或雙相疫苗。
上述技術方案中，所述的宿主細胞為可增殖豬圓環病毒病毒Ⅱ型（PCV2）的細胞系，如PK15細胞系等。
上述技術方案中，所述的載體為網狀（或球形、或片狀）的聚酯（或明膠、或多糖）微載體。
上述技術方案中，步驟（1）中所述微載體用量為80克/升、細胞的初始接種量為1.4×10～2.6×10cells/g微載體較好。
上述技術方案中，步驟（2）中所述接種病毒時細胞密度為5.0×10cells/升～8.0×10cells/升。
上述技術方案中，細胞培養的環境為溫度37℃，CO2濃度為5％，培養液pH值為7.0-7.6。
上述技術方案中，步驟（2）中所述接種病毒時按病毒感染複數（M.O.I.）為0.01～1的比例。
上述技術方案中，步驟（1）中所述細胞培養時一般貼附4小時後開始培養程式。
上述技術方案中，步驟（2）中所述接種病毒時一般吸附4小時後開始病毒培養程式。
該發明方法中培養細胞和病毒，可在生物反應器中進行。生物反應器主要包括載體瓶、儲液罐、pH控制器、DO監測器、輸入和輸出系統。工作過程如下：細胞貼附在載體瓶中載體上生長，當儲液罐的培養液被泵入載體瓶時，培養液液面上升向細胞供給養分並促進細胞新陳代謝產物的去除；當載體瓶的培養液泵入儲液罐時，培養液面隨之下降，使細胞進行通風，促進呼吸，減小細胞切向壓力，無O2供應限制，無泡沫煩惱。這個重複的運動使載體上的細胞能夠得到足夠的營養和O2，同時產生的代謝廢物像CO2能夠有效的被排出去，從而能夠大量的擴增細胞並增殖病毒，此種技術稱之為潮汐式微載體懸浮培養技術。
實施案例
實施例1 潮汐式微載體懸浮生物反應器大規模生產豬圓環病毒Ⅱ型（PCV2）
該實施例中所使用的生物反應器為潮汐式微載體生物反應器，所使用的微載體為聚酯纖維。寬5毫米，長10毫米，1克載體提供2,400平方厘米的貼壁面積，可提供1.0×10以上數量的細胞生長。
（1）將PK15細胞3.2×10cells接種於20升載體罐中並添載入體聚酯纖維1600克，以及工作體積為500升的含6％牛血清的DMEM生長用培養液，潮汐式微載體懸浮培養技術培養至細胞總數達到1.28×10cells；培養細胞時先啟動貼附程式，4小時後換成培養程式；細胞貼附程式為：Up：2500毫升/分鐘；Hold1分鐘；Down：2500毫升/分鐘；Hold30秒，設定最大換液量18.5升；細胞培養程式：Up：1900毫升/分鐘；Hold1分鐘；Down1900毫升/分鐘；Hold1分鐘，設定最大換液量18升。
（2）將細胞生長用培養液全部更換為含2％牛血清的維持用DMEM培養液，並同步（M.O.I.＝0.1）加入豬圓環病毒Ⅱ型（PCV2），於37℃培養，控制二氧化碳濃度5％，pH值7.2；接種病毒時先啟動病毒吸附程式，4小時後換成病毒培養程式；病毒吸附程式為：Up：1600毫升/分鐘；Hold1分鐘；Down：1600毫升/分鐘；Hold30秒、設定最大換液量18.5升；病毒培養程式：Up：1000毫升/分鐘；Hold1分鐘；Down1000毫升/分鐘；Hold1分鐘、設定最大換液量18升。其中，Up為培養液通過微載體的上升速度，Down為培養液通過載體的下降速度，Hold為微載體浸泡在培養液中的時間；
（3）培養24小時後將載體罐內維持液棄去，細胞用0.01摩爾/升的PBS（pH7.4）充分洗滌，加入300毫摩爾/升D-氨基葡萄糖孵育30分鐘（D-氨基葡萄糖添加量以剛好淹沒載體為準，孵育期間設備程式暫停，靜止孵育）；
（4）棄去D-氨基葡萄糖，將細胞用0.01摩爾/升的PBS（pH7.4）充分洗滌以除去載體上殘留的D-氨基葡萄糖，加滿細胞維持液繼續培養細胞；
（5）連續培養10天后收穫病毒液，於-20℃冷凍、20℃融解，反覆兩次後，進行病毒液檢驗：
（a）純淨性檢驗：按《中華人民共和國獸藥典》2005版附錄15、19、20頁相關規定進行檢驗，結果無細菌、黴菌、支原體及外源病毒污染。
（b）病毒含量測定：將病毒液用含300毫摩爾/升D-氨基葡萄糖和2％牛血清細胞維持液作10倍梯度系列稀釋，從10到10。每個稀釋度接種8個孔，同時設立陰性不接毒對照，放入5％CO2溫箱中37℃培養48～72小時，80％丙酮固定，用免疫螢光抗體（IFA）方法測定每個稀釋度含有PCV2陽性細胞（綠色螢光）的孔數，根據Reed-Muench法計算病毒液TCID50，每1.0毫升含病毒≥10TCID50；
（c）特異性：用間接免疫螢光抗體（IFA）方法測定。將病毒液接種於96孔細胞板PK15細胞，每個樣品4孔，每孔200微升，同時設立陰性對照，放入5％CO2溫箱中37℃培養48～72小時；棄去生長液，用0.01摩爾/升的PBS緩衝液（pH7.4）洗滌細胞2次，然後加入100微升預冷的80％丙酮溶液，4℃固定30分鐘。然後用PBS洗滌3次；棄掉維持液，PBS洗滌3次後，每孔加入100微升用PBS1:100稀釋的豬抗PCV2血清，37℃作用1小時；用PBS洗滌3次，每次3分鐘後；加入用PBS1:100稀釋的螢光標記的兔抗豬IgG的二抗（IgG-FITC），每孔100微升，37℃作用1小時；用PBS洗滌3次，每次3分鐘，在螢光顯微鏡下觀察。細胞對照孔應無特異性螢光出現，而病毒接種細胞孔應有大量特異性螢光出現。
實施例2 豬圓環病毒Ⅱ型（PCV2）滅活疫苗的製備及免疫效力評價
1.材料與方法
1.1疫苗
實施例1得到的豬圓環病毒Ⅱ型（PCV2）病毒液按1:1比例加入206佐劑（法國SEPPIC公司產品），充分混合均勻即得（批號為：0803、0804、0805、0806和0807）。
1.2.試驗動物
PCV2ELISA抗體和PCV2抗原陰性仔豬，購自河南洛陽。
1.3.安全性試驗
1.3.1.最小免疫日齡仔豬一次單劑量接種
取7日齡哺乳仔豬30頭，分成6組，每組5頭，第l～5組肌肉注射5個批次疫苗，接種劑量2毫升/頭；第6組為空白對照組，編號並稱體重後隔離飼養30天，觀察仔豬有無臨床症狀。接種後1～7天每天測量體溫（直腸溫度）。
1.3.2.仔豬單劑量重複接種
取15～18日齡哺乳仔豬30頭，分成6組，每組5頭，第1～5組肌肉注射5個批次疫苗，接種劑量2毫升/頭，接種後2周，再用相同劑量免疫一次；第6組為空白對照組。編號並稱體重後隔離飼養30天，觀察仔豬有無臨床症狀。接種後1～7天每天測量體溫（直腸溫度）。
1.3.3.仔豬一次超劑量接種
取15～18日齡哺乳仔豬30頭，分成6組，每組5頭，第1～5組肌肉注射5個批次疫苗，接種劑量4毫升/頭；第6組為空白對照組，編號並稱體重後隔離飼養30天，觀察仔豬有無臨床症狀。接種後1～7天每天測量體溫（直腸溫度）。
1.4.抗體檢測與攻毒保護試驗：
選擇35頭15～18日齡PCV2ELISA抗體和PCV2抗原陰性斷奶仔豬，隨機分成7組，5頭/組，第1、2、3、4、5組免疫0803、0804、0805、0806和0807批滅活苗，頸部肌肉注射免疫，2毫升/頭，兩周后用相同免疫劑量加強免疫一次；第6組為攻毒對照組；第7組為空白對照組，只接種鑰匙孔血藍蛋白（KLH/ICFA）和巰基乙酸培養基。二免後3周用PCV2病毒攻擊，肌肉注射，3×10TCID50/頭，攻毒後第4、7天分別在豬的兩腋下及兩臀部分四點接種用弗氏不完全佐劑乳化的鑰匙孔血藍蛋白（KLH/ICFA，0.5毫克/毫升），4毫升/頭，腹腔接種巰基乙酸培養基，10毫升/頭；攻毒後第11、19天僅腹腔接種巰基乙酸培養基，10毫升/頭。檢測指標：（1）分別於首免後14、21、35天採血，測定ELISA抗體和中和抗體效價，觀察抗體產生動態。（2）攻毒後1～20天測量體溫，觀察臨床症狀。（3）組織病理學觀察。
1.5.ELISA抗體檢測
用大腸桿菌表達的PCV2-ORF2蛋白作為抗原，通過方陣滴定試驗確定抗原的最佳包被濃度。將抗原稀釋到最佳包被濃度後包被酶標板，100微升/孔，37℃作用2小時後4℃包被過夜；洗滌3次，每次3-5分鐘；每孔加200微升的0.15％BSA封閉液封閉板子，37℃作用2小時；洗滌；將待檢血清用PBS倍比稀釋，每個樣品一行，每孔加100微升，37℃作用1小時；洗滌；然後加入酶標的SPA（1:10000倍稀釋），100微升/孔，37℃作用1小時；洗滌；加底物液TMB（3′，3′，5′，5′，-四甲基聯苯胺）顯色，最後用2摩爾/升的H2SO4終止反應。結果判定：待檢血清OD450值/陰性血清OD450值≥2.1為陽性。
1.6.血清中和試驗
採用固定病毒稀釋血清法。待檢血清56℃加熱30分鐘，10000轉每分離心5分鐘，小心吸出上清，做1:2稀釋後進行倍比稀釋；分別與等量100TCID50PCV2病毒液混合，37℃1小時，接種於含PK15細胞單層的96孔板內，100微升/孔，每一稀釋度接種4孔，同時設細胞對照和病毒對照孔。37℃培養12小時，用300毫摩爾/升的D-氨基葡萄糖處理，37℃繼續培養48小時，80％丙酮固定細胞，用間接免疫螢光法測定每個稀釋度含有螢光的孔數。以能夠抑制50％特異性螢光細胞數的細胞孔的血清最大稀釋度作為待檢血清的中和效價，並計算每組平均值。
1.7.病理學檢查
按常規方法進行病理解剖，觀察臟器病理變化，並採集肺臟、脾臟、淋巴結等臟器4％福馬林固定後，製備石蠟切片，HE染色，顯微鏡觀察組織病變。
2.結果
2.1.疫苗安全性
5批疫苗分別做最小日齡仔豬一次單劑量接種以及仔豬單劑量重複接種和仔豬一次超劑量接種後均表現發育良好，精神狀態、食慾正常，無體溫升高和其他不良反應。證明該疫苗安全性良好。結果見表2～4。
組別 | 臨床表現 | 平均體溫（℃） | ||||||
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | ||
疫苗0803 | 正常 | 39.2 | 39.4 | 39.5 | 39.3 | 39.4 | 39.2 | 39.5 |
疫苗0804 | 正常 | 39.5 | 39.6 | 39.2 | 39.4 | 39.1 | 39.3 | 39.2 |
疫苗0805 | 正常 | 39.4 | 39.3 | 39.2 | 39.3 | 39.5 | 39.3 | 39.4 |
疫苗0806 | 正常 | 39.4 | 39.2 | 39.2 | 39.4 | 39.5 | 39.4 | 39.1 |
疫苗0807 | 正常 | 39.2 | 39.6 | 39.4 | 39.5 | 39.3 | 39.4 | 39.3 |
對照組 | 正常 | 39.3 | 39.2 | 39.3 | 39.4 | 39.4 | 39.5 | 39.3 |
組別 | 臨床表現 | 平均體溫（℃） | ||||||
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | ||
疫苗0803 | 正常 | 39.3 | 39.5 | 39.5 | 39.2 | 39.4 | 39.3 | 39.4 |
疫苗0804 | 正常 | 39.4 | 39.4 | 39.3 | 39.4 | 39.3 | 39.5 | 39.5 |
疫苗0805 | 正常 | 39.5 | 39.4 | 39.2 | 39.4 | 39.3 | 39.5 | 39.3 |
疫苗0806 | 正常 | 39.4 | 39.5 | 39.5 | 39.3 | 39.4 | 39.3 | 39.4 |
疫苗0807 | 正常 | 39.3 | 39.6 | 39.5 | 39.4 | 39.5 | 39.3 | 39.5 |
對照組 | 正常 | 39.5 | 39.3 | 39.4 | 39.3 | 39.5 | 39.5 | 39.4 |
組別 | 臨床表現 | 平均體溫（℃） | ||||||
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | ||
疫苗0803 | 正常 | 39.3 | 39.4 | 39.4 | 39.3 | 39.3 | 39.2 | 39.4 |
疫苗0804 | 正常 | 39.5 | 39.3 | 39.2 | 39.4 | 39.3 | 39.3 | 39.3 |
疫苗0805 | 正常 | 39.3 | 39.4 | 39.5 | 39.3 | 39.3 | 39.2 | 39.4 |
疫苗0806 | 正常 | 39.3 | 39.2 | 39.2 | 39.3 | 39.5 | 39.7 | 39.1 |
疫苗0807 | 正常 | 39.2 | 39.5 | 39.3 | 39.5 | 39.5 | 39.4 | 39.5 |
對照組 | 正常 | 39.4 | 39.5 | 39.2 | 39.4 | 39.5 | 39.6 | 39.3 |
2.2.免疫豬PCV2抗體檢測
免疫後14天，免疫組均能檢測到PCV2抗體；首免疫後35天，疫苗免疫組ELISA抗體和中和抗體效價分別達1:3200和1:32以上，而且，ELISA抗體和中和抗體水平基本一致。結果見表5。
組別 | 首免後不同時間ELISA抗體平均值 | 中和抗體平均值 | ||||
14天 | 21天 | 35天 | 14天 | 21天 | 35天 | |
疫苗0803 | 1:320 | 1:1120 | 1:5760 | 1:4.8 | 1:22.4 | 1:57.6 |
疫苗0804 | 1:240 | 1:960 | 1:3840 | 1:4 | 1:16 | 1:38.4 |
疫苗0805 | 1:200 | 1:800 | 1:3200 | 1:4 | 1:14.4 | 1:32 |
疫苗0806 | 1:280 | 1:1120 | 1:4480 | 1:4.8 | 1:22.4 | 1:51.2 |
疫苗0807 | 1:280 | 1:960 | 1:3840 | 1:4 | 1:16 | 1:44.8 |
攻毒對照組 | <1:50 | <1:50 | <1:50 | <1:4 | <1:4 | <1:4 |
空白對照組 | <1:50 | <1:50 | <1:50 | <1:4 | <1:4 | <1:4 |
2.3.攻毒保護試驗
2.3.1.臨床症狀
攻毒對照組所有豬攻毒後第1～3周體溫升高（＞40℃），持續3～6天，攻毒後第10天出現被毛粗亂、食慾減退現象，第11天有1頭死亡；空白對照豬在整個攻毒期中體溫始終保持正常，無異常臨床表現。0803、0804、0805、0806和0807批疫苗免疫的豬，攻毒後第1周均有2～3頭豬出現體溫超過40℃，持續1～2天，但均未見到明顯異常臨床表現。5批疫苗保護效率分別100％、100％、100％、100％和100％。結果見表6。
2.3.2.體重變化
為了評價疫苗對豬體的保護效果，我們分別在攻毒前及宰殺時對豬體進行稱重，計算各組平均相對日增重，利用統計學軟體SPSS17.0進行統計分析，結果表明疫苗免疫組豬相對日增重與空白對照組相似（P＝0.5＞0.05），但明顯高於非免疫攻毒對照組（P＝0.02＜0.05），證明疫苗均有較好免疫保護作用。
2.3.3.病理變化
攻毒後第11天，攻毒對照豬1頭死亡，病理剖解表現為肺臟出血、彈性變低，腹股溝、髂下、頜下、腸系膜淋巴結腫脹、出血，脾臟邊緣輕微出血等。攻毒後第20天，即試驗結束時，撲殺所有試驗豬，進行病理解剖和組織病理學檢查。試驗結果表明非免疫攻毒對照組豬有明顯肉眼病理變化，淋巴結組織中淋巴細胞缺失、巨噬細胞浸潤、包涵體病變；肺臟組織有單核細胞浸潤；而免疫豬病理變化很不明顯。具體結果見表7。
組別 | 臨床症狀 | 攻毒後體溫≥40℃的天數 | 攻毒後體溫≥40℃的頭數 | 發病否 | 保護率（％） |
疫苗0803 | 正常 | 0~5 | 3 | - | 100% |
疫苗0804 | 正常 | 0~2 | 3 | - | 100% |
疫苗0805 | 正常 | 0~5 | 2 | - | 100% |
疫苗0806 | 正常 | 0~3 | 3 | - | 100% |
疫苗0807 | 正常 | 0~2 | 2 | - | 100% |
攻毒對照組 | 異常※ | 3~6 | 5 | + | / |
空白對照組 | 正常 | 0 | 0 | - | / |
※：被毛粗亂，皮膚蒼白，食慾減退，有死亡現象。 | |||||
組別 | 病理變化 | ||||
肺實變等 | 淋巴結腫大 | 腎有壞死點 | 脾輕度腫大 | 腸道鼓氣等 | |
疫苗0803 | 2/5 | 1/5 | 0/5 | 0/5 | 1/5 |
疫苗0804 | 1/5 | 0/5 | 0/5 | 0/5 | 0/5 |
疫苗0805 | 2/5 | 1/5 | 0/5 | 0/5 | 1/5 |
疫苗0806 | 1/5 | 0/5 | 0/5 | 0/5 | 0/5 |
疫苗0807 | 1/5 | 0/5 | 0/5 | 0/5 | 0/5 |
攻毒對照組 | 5/5 | 5/5 | 4/5 | 3/5 | 4/5 |
空白對照組 | 0/5 | 0/5 | 0/5 | 0/5 | 0/5 |
3.結論
該研究用5批豬圓環病毒Ⅱ型滅活疫苗接種仔豬，結果均無異常臨床表現，安全性很好；仔豬免疫後14天產生ELISA抗體和中和抗體，首免後35天攻毒，無異常臨床表現和病理變化，免疫保護效率達100％，免疫效果良好。且以該發明採用新的工藝參數運用潮汐式微載體細胞懸浮培養系統生產豬圓環病毒滅活疫苗無論是抗原含量、產量還是生產成本等指標，遠優於常用轉瓶培養系統。
榮譽表彰
2014年11月6日，《豬圓環病毒Ⅱ型疫苗及其生產方法》獲得第十六屆中國專利優秀獎。
