調控雞球蟲性別分化與發育相關蛋白基因的克隆與鑑定

《調控雞球蟲性別分化與發育相關蛋白基因的克隆與鑑定》是依託揚州大學，由陶建平擔任項目負責人的面上項目。

基本介紹

• 中文名：調控雞球蟲性別分化與發育相關蛋白基因的克隆與鑑定
• 項目類別：面上項目
• 項目負責人：陶建平
• 依託單位：揚州大學

項目摘要

雞球蟲病是由艾美耳球蟲引起的一種嚴重危害養雞業的重大疾病。艾美耳球蟲的生活史在頂復門原蟲中最簡單直接，由卵囊經糞-口在宿主間傳播。認為艾美耳球蟲的性別分化和發育取決於有性階段特異基因的差異表達，有性階段基因在最後一代裂殖子中可能就有表達，但對這些差異表達的基因及其功能知之甚少。雞球蟲的裂殖生殖一般是3代。毒害艾美耳球蟲的第一、二代裂殖生殖發生在小腸黏膜上皮細胞內，第三代裂殖生殖和配子生殖發生在盲腸黏膜上皮細胞內，易於鑑別分離。因此，本項目採用SSH、cDNA晶片、實時定量PCR、SMART-RACE等技術，克隆與鑑定毒害艾美耳球蟲第二代裂殖子、第三代裂殖子、大配子體階段的特異表達基因，並進行原核表達；採用組織切片、免疫細胞化學、免疫電鏡、ELISA、流式細胞術等方法或技術，分析與鑑定這些發育階段特異性表達基因的功能，解析艾美耳球蟲性別分化和發育的分子基礎，為尋找防控雞球蟲病新方法奠定基礎。

結題摘要

艾美耳球蟲的生長發育和性別分化取決於基因在蟲體不同發育階段的差異表達，性別分化相關基因可能在最後一代裂殖子中就有表達，但對這些差異表達的基因及其功能知之甚少。本項目在建立了分離與純化毒害艾美耳球蟲子孢子、第2代裂殖子、第3代裂殖子和配子體方法的基礎上，通過對第2、3代裂殖子間消減cDNA文庫的構建與分析，第2代裂殖子、第3代裂殖子、配子體的轉錄組比較與分析，子孢子、第2代裂殖子、第3代裂殖子、配子體cDNA噬菌體表達文庫的構建與分析，獲得球蟲不同發育的差異表達基因以及球蟲生長發育相關基因序列。差異表達基因經GO功能富集分析和KEGG通路富集分析後，篩選出與球蟲生長發育、性別分化和發育的相關基因，並通過qRT-PCR驗證。選擇差異表達基因進行克隆、表達與功能研究。共構建了4個cDNA噬菌體表達文庫，篩選後獲得29個基因序列。構建了2個消減cDNA文庫，獲得了11個差異表達基因。完成了第2、3代裂殖子和配子體的轉錄組測序與分析。在第2、3代裂殖子間鑑定出2053個差異表達基因，其中第2代裂殖子顯著上調錶達基因1216個，特異性表達基因95個，第3代裂殖子顯著上調錶達基因837個，特異性表達基因48個，主要包括ApiAP2 DNA結合蛋白、艾美耳球蟲特異性表面抗原、CMGC激酶、DEAD/DEAH盒解旋酶結構域蛋白和增殖相關蛋白2G4基因等。在第3代裂殖子和配子體間鑑定出4267個差異表達基因，其中第3代裂殖子顯著上調錶達基因1478個，特異性表達基因 329個，第3代裂殖子顯著上調錶達基因2789個，特異性表達基因1289個，有51個與卵囊壁生物合成相關，22個與卵囊壁抗酸脂層的合成與重塑相關，33個與小配子體發育相關。克隆、表達了EnPIPK、EnCK2、EnAGC、EnHAP2、EnDlc、EnArm、EnMAPRE3、EnSNF2基因，免疫螢光定位研究顯示這些基因在球蟲不同發育階段以及雌雄配子體上差異表達或特異性表達，預示參與調控球蟲生長發育、性別分化和發育。重組蛋白EnHAP2和EnSNF2免疫雛雞能產生一定的免疫保護力。本項目研究結果為進一步解析艾美耳球蟲性別分化和發育奠定了重要的基礎，也為研製雞球蟲病亞單位疫苗提供了候選基因。