誘導骨髓間充質幹細胞分化為單倍體雄性生殖細胞

《誘導骨髓間充質幹細胞分化為單倍體雄性生殖細胞》是依託北京大學，由崔光輝擔任負責人的面上項目。

基本介紹

• 中文名：誘導骨髓間充質幹細胞分化為單倍體雄性生殖細胞
• 項目負責人：崔光輝
• 依託單位：北京大學
• 項目類別：面上項目

項目摘要

非梗阻性無精症是導致男性不育的主要原因之一，且目前尚無有效治療手段。本研究在以往的工作基礎上，首先擬採用細胞內激酶抑制劑處理、高濃度胚胎幹細胞提取物誘導和四基因（OCT4, KLF4, c-MYC, SOX2）逆轉錄病毒載體轉染相結合的方式促使骨髓間充質幹細胞發生胚胎幹細胞樣變，以形成誘導性多能細胞，提高細胞的多向分化能力。隨後利用視黃酸刺激和細胞製備擬胚體的方法促使誘導性多能細胞發生向生精細胞的分化。最後採用與生殖嵴細胞共培養和生精小管移植的方法促進誘導的細胞發生向生精細胞的進一步分化，並最終進入減數分裂形成單倍體的精子細胞或精子。此項研究的開展可以在一定程度上揭示幹細胞分化的機理，並為臨床治療無精症提供理論基礎。

結題摘要

本研究基本按照項目申請書設計的技術路線開展，其中個別步驟在參考最新文獻的基礎上做出了相應的修改。由於本研究難度大耗時長，目前已完成誘導的生殖細胞受體小鼠曲細精管移植一個月後細胞分化狀況的檢測，移植三個月和五個月後分化狀況的檢測有待後續進行。 從小鼠骨髓和脂肪組織中成功分離培養出間充質幹細胞。採用四因子（OCT4, KLF4, c-MYC, SOX2）逆轉錄病毒轉染的方式成功誘導間充質幹細胞去分化產生胚胎幹細胞（ESC）樣變。產生的ESC樣細胞表達鹼性磷酸酶、細胞多功能相關基因；可以自發形成擬胚體，擬胚體中細胞形成三胚層分化。由於脂肪組織來源的間充質幹細胞具有抵抗化療藥物和增殖迅速的特點，因此在隨後的研究中以脂肪組織來源的間充質幹細胞替代了骨髓來源的間充質幹細胞。 經去分化形成的ESC樣細胞在被誘導生成外胚層和原始生殖細胞過程中細胞集落形態出現改變。向外胚層和原始生殖細胞誘導過程中細胞多能性相關基因（Oct3, Sox2, Klf4, and Nanog）和與生殖細胞形成相關的Blinp-1和Stella基因轉錄量升高。在從ESC樣細胞到外胚層樣細胞及原始生殖樣細胞的誘導過程中細胞內組蛋白甲基化酶H3K9me2的表達水平逐漸下降；H3K27me3的表達水平開始出現下降，隨後輕微上升。採用免疫磁珠的方法從誘導的細胞中獲取了SSEA-1陽性細胞，分離出的細胞表達原始生殖細胞表面標誌Blimp-1和Stella。與未經誘導的間充質幹細胞和ESC樣變細胞相比， 誘導生成的原始生殖細胞樣細胞其H19和Igf2r基因的甲基化程度明顯降低，類似於處於胚胎髮育中的原始生殖細胞的甲基化狀態。 獲取的原始生殖細胞樣細胞在移植進入受體小鼠曲細精管一個月後聚集在靠近管壁的部位，尚未在管腔內形成典型的精子發生樣結構。後續三個月和五個月的移植結果有待進一步觀察。 研究取得的部分結果在國際專業雜誌發表英文論文2篇(Cell Biol Int 2012;36:857-862; 2012;36:491-495)，另有1篇英文論文已投稿。在國核心心期刊發表中文論文2篇（中國男科學雜誌2011;25(6):3-7 2013;27(6):3-7）。項目進行中培養在職碩士研究生1名。