蛋白質雙末端肽的標記定量和新蛋白的發現研究

《蛋白質雙末端肽的標記定量和新蛋白的發現研究》是依託復旦大學，由張祥民擔任項目負責人的面上項目。

基本介紹

• 中文名：蛋白質雙末端肽的標記定量和新蛋白的發現研究
• 依託單位：復旦大學
• 項目類別：面上項目
• 項目負責人：張祥民

項目摘要

蛋白質雙末端的胺基酸序列對於絕大多數蛋白具有唯一性。本項目通過蛋白雙末端肽標記新技術，研究探索蛋白質的發現、鑑定、確認以及準確定量的新方法，發現一批新的未曾鑑定蛋白質。首先，研究篩選一系列螢光標記探針分子，選出對質譜電離效率和對串級譜解析沒有影響的螢光標記分子；進而研究標記蛋白的固相酶解新技術、標記肽與非標記肽高效純化技術，得到高純度的雙末端肽標記肽樣品。末端標記肽經過多維高效液相色譜充分分離和雷射誘導螢光準確測定得到濃度含量信息；通過串級質譜鑑定得到末端肽的所指向的蛋白質，從中發現未知蛋白。蛋白質雙末端肽定量能夠對蛋白質的濃度含量得到雙重確認，準確性大幅提高，採用螢光標記，使得蛋白質定量檢測靈敏度也得到大幅提高。因此，蛋白質雙末端肽段的定量與鑑定具有特別重要的學術意義，為未知蛋白和低豐度的生物標誌物的發現提供新的研究方法和技術途徑。

結題摘要

項目針對蛋白質的雙末端肽進行了標記、定量和新蛋白的發現等新方法研究。在標記方面，發展建立了FLAQ（Fluorescence Labeling Absolute Quantification）螢光標記蛋白質絕對定量新方法。該方法能夠實現定量標記，標記肽段不影響串級質譜的鑑定，經過標準肽和實際樣品驗證了方法的準確性。同時，還發展了複雜的血漿蛋白質組分的染色標記定量新方法，並採用自主建立的陣列多維液相色譜系統分離鑑定了1474個血漿蛋白質。 鑑定蛋白質末端序列與修飾對於確定蛋白質的生物功能和相互作用具有重要意義。研究發展了末端肽選擇性提取新方法。採用2種固相新材料固定非末端肽，一次去除所有非末端肽技術方法，通過三氟甲磺酸基團功能材料將非末端肽段反應後分離出去，獲得對應的末端肽。方法成功套用於鼠肝實際樣品，共鑑定到122條乙醯化蛋白末端，和106條游離蛋白末端。發展的第二固相材料是基於巰基衍生和納米金材料去除非末端肽的分離新方法。利用雙甲基化對蛋白質中所有游離氨基進行蛋白質層面的封閉。酶解後，再用特勞特試劑對非末端肽進行快速巰基衍生，繼而使用納米金材料對巰基衍生的非末端肽進行完全清除，得到蛋白質的末端肽段。鼠肝實際樣品分析表明，該方法可鑑定到632蛋白末端肽。 研究發展了蛋白質共價結合固定化技術及其在新蛋白發現方面的新技術方法。研製了三氟乙磺酸基團修飾的多孔高分子聚合物，實現了對膜蛋白的共價固定和原位酶解。樣品中的增溶劑、磷脂等可通過洗滌以及磁性分離被徹底除去。蛋白在材料表面形成蛋白質單分子層，能夠被更完全地酶解。實驗表明，從小鼠肝臟膜蛋白提取餾分中，共鑑定出5936中蛋白質，其中2946種為膜蛋白。通過對比Peptideatlas資料庫，發現了735種未被鑑定過的蛋白質，可能為新發現蛋白。 發現了雷射特異酶解獲得末端肽新技術，將其用於糖化血紅蛋白大規模、高通量的測定與定量，有望用於糖尿病臨床快速高通量篩查。同時，還研究發展了100個活細胞蛋白質組的超高靈敏度分離鑑定新技術裝置（iPAD-100）。首次實現了100細胞蛋白質組的超靈敏度分析。DLD細胞蛋白質組能夠鑑定813個蛋白質，最低含量達到200zmol。在臨床醫學和生命過程分析，如循環腫瘤細胞、幹細胞等稀有細胞的蛋白質組分析與比較等方面具有主要套用前景。