蘋果實生樹個體發育不同階段的蛋白質差異表達分析

《蘋果實生樹個體發育不同階段的蛋白質差異表達分析》是依託中國農業大學，由張新忠擔任項目負責人的面上項目。

基本介紹

• 中文名：蘋果實生樹個體發育不同階段的蛋白質差異表達分析
• 依託單位：中國農業大學
• 項目負責人：張新忠
• 項目類別：面上項目

項目摘要

多年生木本被子植物的個體發育過程分為童期、成年營養生長期和生殖生長期三個階段，目前階段轉變的生理與分子機制尚不清楚。申請人已經找到了蘋果實生樹童期結束和生殖生長期起始的臨界點，篩選到了不同發育階段的激素、多酚等標記，並已通過SDS-PAGE檢測到了階段轉變差異蛋白質譜帶的存在。本項目採用2-DE DIGE、串聯質譜和生物信息學方法分析蘋果實生樹不同個體發育階段蛋白質的差異表達，分別製備部分差異表達蛋白質的多克隆抗體和寡聚核苷酸探針，通過ELISA和RNA Blot方法對差異表達蛋白質及其編碼mRNA進行驗證；再用免疫組化法和RNA原位雜交技術分析差異表達蛋白質及其編碼mRNA的時空表達特性。對認識植物個體發育過程中基因表達和調控有意義。

結題摘要

以蘋果雜種實生樹（‘紅玉’ב金冠’） 02-18-034為試材，通過差異螢光差異凝膠電泳雙向電泳（DIGE），檢測到差異表達蛋白質點122個，其中，童期、成年營養生長期和生殖生長期特異蛋白質點分別為44個、17個和29個。經MALDI-TOF-TOF質譜鑑定得到95個蛋白質點。23個光合相關蛋白質表現為童期豐度高，暗示著童期光合活性強於成齡期。10個與蛋白代謝相關的酶和輔因子在成齡期高豐度表達，表明階段轉變過程中蛋白代謝加強。30個蛋白質點系由6種蛋白質經翻譯後修飾而來。利用蛋白印跡和免疫組織化學法及RT-PCR方法對特異蛋白質S6PDH在‘紅玉’ב金冠’和‘紫塞明珠’ב富士’各3株實生樹上驗證。通過鹼性磷酸酶處理和Pro-Q Diamond 螢光染色，在階段轉變過程中分離鑑定了107個差異磷酸化蛋白質點，其中 55個Rubisco大亞基，27個Rubisco activase和25個β-tubulin的豐度和磷酸化度不同個體發育階段均存在顯著變化。用同一株雜種實生樹樣品建立SSH童期和成年期的消減文庫，分別獲得童期和成年期特異表達EST 85個和103個。6個脂類代謝和7個次生代謝相關的EST只在成年期出現。32個蛋白質代謝相關EST中有62.5%在成年期特異出現。5個與Auxin，GAs，ABA和ETH回響相關的EST均只出現在童期。參與氧化還原反應的基因在童期和成年期不同。4個編碼Rubisco小亞基rbcS的EST，均與MDP0000731480的3’ UTR序列匹配。其中3個EST 在童期上調錶達，1個EST在成年期上調錶達。這4個EST僅在3’ UTR 序列上存在差異。4個位於MDP0000243585上的編碼金屬硫蛋白like的EST和2個編碼NADP-甘油醛磷酸脫氫酶的EST的3’ UTR序列也表現出顯著差異。用qPCR對2個組合各3株實生樹樣品對隨機選取的差異表達基因驗證。通過半定量PCR對存在3’UTR 的差異修飾的4個rbcS EST驗證。本研究表明，蘋果實生樹階段轉變過程中不僅存在轉錄水平的調控，也存在轉錄後水平上的調控；激素回響、氧化還原調控、次生代謝和蛋白質代謝均與蘋果階段轉變密切相關。階段轉變過程中蛋白質磷酸化存在顯著變化。