藥物毒理學

藥物毒理學是根據藥物的理化特性, 運用毒理學的原理和方法, 對藥物進行全面系統的安全性評價並闡明其毒性作用機制, 以便降低藥物對人類健康危害程度的一門科學；其主要目的在於指導臨床合理用藥, 降低藥物不良反應及減少因藥物毒性導致的新藥開發失敗。在現代醫學中許多藥物的研究與研發都是基於藥物毒理學展開的。最普通的例子就是對於蛇毒的套用以及對於嗎啡的套用。

藥物毒理學是根據藥物的理化特性, 運用毒理學的原理和方法, 對藥物進行全面系統的安全性評價並闡明其毒性作用機制, 以便降低藥物對人類健康危害程度的一門科學；其主要目的在於指導臨床合理用藥, 降低藥物不良反應及減少因藥物毒性導致的新藥開發失敗。近年來, 分子生物學、細胞生物學、系統生物學等前沿學科及相關技術, 特別是基因組學、蛋白質組學和代謝組學的飛速發展賦予了藥物毒理學新的發展契機, 使之經歷了研究思路、方法、技術和理念的巨大轉變, 從而真正實現了其從器官、組織水平向分子甚至基因水平的飛躍。

1. 我國藥物毒理學研究現狀

我國的藥物毒理學研究開展較晚，可追溯到20世紀80年代。中國藥理學會（藥物）毒理專業委員會成立之後，就開始在國內宣傳藥物審評辦法的實施；1989年首次在國內提出“GLP”的概念以及制定和實施我國GLP；1990年開始參與1985年所制定藥物安全性評價指導原則的修訂和參與國家藥物毒性試驗技術指導原則的制定，特別值得一提的是，負責我國最早的GLP的起草和實施工作。近年來，我國藥物毒理學研究取得豐碩的研究成果，特別在藥物毒理學學科建設與人才培養、GLP規範的制定與實施和創新藥物臨床前安全性評價、政府決策諮詢、新藥審評和風險評估、傳播藥物毒理學科學知識，保障人們用藥安全服務等方面發揮了不可替代的作用。整體而言，我國的藥物毒理學研究與國際上的藥物毒理學研究實踐以及我國新藥研發的發展水平相一致。

2.國外藥物毒理學發展新趨勢

與國內藥物毒理學快速發展相比， 國外藥物毒理學研究發展更為迅速， 特別是近5年， 國外藥物毒理學研究範式也正在發生巨大變革， 其突出內容就是生物標誌物研究力度加大， 凸顯轉化毒理學研究的重要性， 以滿足藥物研發中提早決策， 縮短新藥開發時間和降低成本的實際需要，並在最可能導致新藥開發失敗的線粒體毒性和人體特有的代謝物毒性問題研究過程中促使製藥企業、學術界和藥政監管部門的聯合協作更加的緊密。

3.藥物毒理學研究的轉化

3.1從傳統毒理學向發現毒理學轉化。

傳統毒理學是以整體實驗為主來研究藥物毒性, 在人力、物力、時間和財力等方面都花費巨大, 也無法滿足海量候選化合物毒性篩選的需要, 因此成為限制整個藥物研發的瓶頸。而發現毒理學的研究將打破這個瓶頸, 既可加快藥物研發進程, 提高研發成功率, 又能減少資源消耗。發現毒理學是指在新藥發現階段或藥物的研發早期對新分子實體(newmolecularentities, NMEs)進行毒性篩選, 及時發現和淘汰因毒性問題而不適於繼續研究開發的化合物或化學結構, 或者是有針對性地設計一些實驗研究, 解決某些重要化合物的特異性毒性問題, 指導合成更安全的同類化學物。

3.2　從整體實驗向體外實驗轉化

近年來, 隨著實驗動物使用的3R(Reduction,Refinement, Replacement)甚至4R(增加Responsibility)原則的倡導與實施, 整體動物實驗面臨嚴峻挑戰, 建立符合3R原則的動物實驗替代法已經成為毒理學研究方法發展的必然趨勢。毒理學替代法指能替代實驗動物、減少所需動物數量或使動物實驗程式得以最佳化或減少動物痛苦的方法或程式。其主要從QSAR模型、體外試驗或套用基因組學、蛋白質組學、代謝組學技術來建立, 其中, 利用體外實驗進行毒性預測的替代法發展最為迅速, 如用於評價藥物肝毒性的離體肝臟灌流模型和用於評價生殖毒性的胚胎幹細胞試驗。現階段動物替代實驗方法已大量套用在藥理毒理學研究中, 其套用價值逐漸被研究者認同。目前的迫切任務是對這些實驗方法進行有效性驗證並探索實踐新的技術方法, 以獲得藥政管理部門的認可,使其用作藥物毒理學研究模型。

3.3　從器官、組織水平向分子、基因水平轉化

和任何學科發展一樣, 藥物毒理學的發展離不開實驗方法和技術的不斷改進、創新和完善, 組學技術的迅速發展, 實現了從整體和器官水平向細胞和分子水平甚至基因水平的飛躍, 促進了毒理學各個研究領域的發展, 對毒理學研究方法、技術的改進產生了重大影響。

4.藥物毒理學的研究方法

4.1整體動物在藥物毒理學研究中的套用_

4.1.1 正常動物

在毒理學領域，藥物的安全性評價體系常用到正常動物，包括嚙齒類動物（如大鼠、小鼠、豚鼠、倉鼠等）和非嚙齒類動物（如家兔、比格犬、猴、小型豬等），這些正常動物主要用於進行急性毒性實驗、長期毒性實驗和特殊毒性實驗等。通過不同的給藥方式給予相應的受試藥物一定時間後，採用特定方法測定各項生理生化指標用於評價受試藥物對健康動物有無毒性，並以此確定試驗動物對毒物的毒性反應、中毒劑量（poisoning dose）和致死劑量（lethal dose）等，為藥物進入臨床階段提供參考依據並將結果外推至人類。經過毒理學工作者的不斷努力，傳統的急性毒性實驗已經在減少動物的使用量上取得了很大的進步，主要表現為套用上下法、固定劑量法、探測劑量法、近似致死劑量法等新的方法替代傳統的急性毒性實驗，並已經很大程度上減少了實驗動物的使用量。

4.1.2 基因動物

對受試物進行器官毒性評價等研究時，經常使用各種模型動物。將誘發性模型動物、轉基因動物、基因敲除動物套用到實驗當中，進而研究各種模型下套用受試物後機體的異常反應，以尋找預測各類疾病更加有效的手段。石艷等用慶大黴素誘導急性腎損傷大鼠模型來測定腎損傷分子-1（kim-1）的表達，並明確了kim-1 可作為慶大黴素所致腎小管損傷的早期診斷標誌物。在毒理學研究領域中，重要的問題是如何把從整體動物獲得的資料外推至人類，把體內外信息結合，把複雜的整體系統化為簡單的可控系統，以及如何提高檢測的敏感性等。建立轉基因動物模型為解決這些問題提供了新手段。轉基因動物模型主要分為一般毒性研究模型、致突變檢測模型、致癌檢測模型、生殖檢測模型和毒物代謝研究模型。，這些轉基因動物的套用不僅提高了實驗動物的敏感性，也一定程度上滿足了動物福利的要求，並且大大縮短了藥物毒性評價時間。繼轉基因技術後，基因敲除動物技術掀起又一場分子生物學技術的革命。這是一種在基因組水平上改變或破壞靶基因結構，使其功能完全喪失的實驗技術。該系統的建立，使得對基因靶位時間和空間上的操作更加明確、效果更加可靠，它的發展將

為發育生物學、分子遺傳學等學科提供一種全新的研究手段，具有廣泛的套用前景。目前，基因敲除動物模型主要用於遺傳性疾病的研究，現在也用於器官移植、免疫耐受、基因功能鑑定以及表型研究。整體動物在毒理學研究中套用廣泛，不同的轉基因動物模型和基因敲除動物模型的建立，將對闡明外源化學物毒性作用機制起到重大作用。但是該方法製作基因動物模型效率低，動物行為難以控制，且基因整合機制不清，存在一定局限性。

4.2 體外替代實驗技術的發展

使用正常動物的實驗在毒理學研究的套用中存在著不敏感、周期長、所需受試物樣品多、所需實驗動物量大、難以揭示毒作用位點和毒作用機制以及結果可靠性差等問題。而模型動物也存在著製造價格昂貴、受世界動物保護法限制等不足之處。因此，在“3R”原則（替代、最佳化、減少，replacement、refinement、reduction）的指導下，一些已開發國家率先開展了替代方法的研究。目前體外替代方法的研究已成為實用性毒理學領域研究的新方向。主要包括離體器官實驗和體外細胞培養實驗。

4.2.1 離體器官實驗

以體內臟器為基礎的體外模型，一方面保留著完整的營養供給系統，能夠確保在一定時間內保持離體器官的正常生理活性及生化功能，另一方面離體系統可排除其他組織器官的干擾，可控制受試物濃度，並可定量觀察受試物對離體系統的毒性作用。目前，離體器官實驗主要採用離體灌流技術，包括離體的肝臟、腎臟、心臟灌流技術等，用於研究外源化合物的靶器官毒性。

4.2.2 體外細胞培養

體外細胞培養使毒理學研究從簡單的整體動物實驗深入到複雜的細胞和分子水平，脫離了整體穩態和內分泌調控作用，從蛋白質、酶、受體、分子通道以及遺傳因素等方面解析了藥物與機體間的相互作用，在投藥準確性和結果可靠性上顯示了優越性。作為體外細胞實驗金標準的原代肝細胞培養技術廣泛套用在毒理學研究各領域，如通過測定培養肝細胞中轉氨酶的活性，評價有機和無機化合物的肝細胞毒性，通過體外培養原代人腎細胞評價黴菌素在人體外腎細胞的吸收、分布、代謝和毒性作用，都獲得了很好的結果。

4.3 組學技術

4.3.1 “組學”的形成

傳統的體內體外實驗主要以整體動物或套用體外培養低等生物、高等生物的組織、細胞、細胞器為模型，以細胞學、生理學、形態學和代謝等生物學指標為檢測終點，對藥物進行早期毒性篩選及機制研究。生物物種間生理代謝均存在差異，將以上實驗結果外推至人類，預測藥物對人體的毒性反應是否可靠，仍是值得深究的問題。為了彌補傳統毒理機制研究方法的不足，近年來國內外毒理學工作者正致力於一系列的組學技術研究。目前把對細胞內DNA、RNA、蛋白質、代謝中間產物的整體分析手段稱為組學技術，主要包括基因組學（genomics）、

蛋白質組學（proteomics）和代謝組學等。Nount利用這些組學技術對候選新藥進行毒理機制研究，從而開創了“反向毒理學”的藥物毒性機制研究新模型。組學技術的發展實現了從器官、組織水平向分子甚至基因水平的飛躍。

4.3.2 基因組學

基因組學利用基因組學的相關信息，將遺傳學與生物信息學相結合，從基因整體水平研究外源化合物的毒性作用，建立毒性作用與基因表達變化之間的關係，從而有效監測接觸外源化合物後基因水平的改變，繼而篩選和鑑別潛在的遺傳毒物，並快速確定未知毒物的作用機制。毒物基因組學（toxicogenomics）將基因組學方法與技術套用於毒理學研究領域，主要採用DNA微陣列技術研究毒物和毒作用機制，其快速發展為毒理學開闢了新的研究領域。基因組學技術有助於對毒物進行分類、檢測，鑑定毒作用機制亞型，判斷細胞損傷的嚴重程度並闡明化學物的各種量–效關係。可以說，基因組學技術的發展對毒理學研究方法、技術的改進產生了巨大的影響，但是基因組學理論尚不完善，存在著一些亟待解決的問題。例如，基因組學技術無統一的標準要求；基因表達的改變與疾病的關聯問題模糊不清等。

4.3.3 蛋白質組學

當從mRNA 水平考慮和對單個蛋白質進行的研究已無法滿足後基因組時代的要求時，蛋白質組學（proteomics）應運而生。蛋白質組學是指研究蛋白質組或套用大規模蛋白質分離和識別技術研究蛋白質組的一門學科，是在蛋白質整體上對疾病機制、細胞模式、功能聯繫等方面進行探索的科學。蛋白質組學以直接參與生命活動的蛋白質為研究目標，界定表達蛋白質過程中涉及的影響因素，現已廣泛融入環境科學、生態毒理學等眾多領域。目前，對蛋白質組進行分離的方法有多種，主要包括二維凝膠電泳、二維液相色譜、毛細管電泳和液相色譜-毛細管電泳等技術。蛋白質組完成分離之後繼而通過質譜技術、蛋白質測序技術、胺基酸組成成分分析等技術對其進行鑑定以及功能研究。毒理蛋白質組學作為毒理基因組學的延伸也已經套用到毒理學研究領域當中，是一種利用全蛋白質表達分析技術，確認生物物種受有害外源化學物影響的關鍵蛋白質和信號通路的組學技術。該技術通過比較特定細胞、組織或器官在毒物作用前後蛋白質譜發生的變化，在短時間內篩選出與毒物相關的差異蛋白，再通過抗體分析技術快速尋找新的毒性蛋白標誌物，因此比傳統毒理學研究方法更具靈敏性和特異性。

4.3.4 代謝組學

基因組學、蛋白質組學的迅猛發展為毒理學研究帶來了新的發展契機，大大促進了毒理學的發展。然而，基於蛋白質組學的研究不能提供機體對外源性毒物刺激的整體應答信息，也不能反映出基因、疾病、毒物等相關因素之間的互動作用，存在一定的局限性。因此，繼基因組學、蛋白質組學之後產生了一種重要的系統生物學——“代謝組學”（metabonomics）。代謝組學是套用現代分析方法對某一生物或細胞在某一特定生理時期內所有低相對分子質量代謝產物同時進行定性和定量分析的一門學科，被認為是“組學”研究的終點，具有全面、

高通量、無偏差地研究生物體內代謝途徑的特點。理、藥物藥效學評價、藥物作用機制、臨床診斷以及基因功能等方面的信息。該研究常用核磁共振和質譜聯用技術，包括氣相色譜-質譜聯用儀和液相色譜-質譜聯用儀等。其中核磁共振光譜分析法套用最為廣泛，具有不損害樣品、處理方法簡單、無需分離過程等優點，但其檢測靈敏度較低。Nicholson研究小組多年來致力於代謝組學的研究，用代謝組學方法對藥物毒性影響的組織器官及其位點進行判斷進而推測藥物作用機制，並確定毒性潛在生物標誌物，為藥物的毒性評價做出了巨大貢獻。

5.藥物毒理學的評價模式

全程式新藥安全性研究評價新模式的首要特徵是重視“發現毒理學”在新藥開發中的作用。作為創新藥物研發體系的重要組成部分，國內藥物毒理學在學科建設、服務創新藥物研發和GLP 建設中均取得了很大的發展。從傳統的臨床前評價、臨床評價的兩階段模式，向早期發現毒理學、臨床前評價、臨床評價、上市後監督再評價的四階段全程評價模式轉變，形成了全程式新藥安全性研究評價的新模式。我國的早期發現毒理學建立了一整套藥物早期毒性最佳化篩選系統，引進了計算機毒性預測系統Topkat；全程式藥物毒理學評價新模式；在實驗技術上開展了以轉基因與人源化的動物、幹細胞體外培養、高內涵與高通量篩選、毒理“組學”等為代表的新興生物醫學技術研究。近年來，為服務於創新藥物研發的需要，我國已建立了一整套藥物早期毒性最佳化篩選系統，包括檢測基本細胞毒性的MTT 比色法，檢測遺傳毒性的Ames 波動試驗、Mini-Ames 試驗、SOS 顯色試驗、基於腔室載玻片的體外微核試驗及染色體畸變試驗、Vitotox試驗和Green Screen HC試驗等；檢查生殖毒性的體外檢測睪丸毒性的大鼠種質細胞原代培養、支持細胞原代培養、原代種質細胞與支持細胞共培養試驗等；檢測發育毒性的大鼠著床後全胚胎培養試驗、小鼠胚胎幹細胞試驗、中腦細胞微團培養試驗和基於PC12 細胞的體外發育神經毒性試驗等；體外檢測致癌性的人永生化支持細胞株培養等模型；以及基於GFP 報告基因系統的CYP450 誘導活性的檢測模型。在藥物致癌性評價中，將轉基因動物模型與野生型動物模型相結合作為替代致癌性試驗方法，已得到廣泛的套用。體外檢測致癌性的人永生化支持細胞株培養等模型，以及基於GFP報告基因系統的CYP450 誘導活性的檢測模型的有效性和可靠性已在相關藥物的研發實踐中得到了證實。全程式藥物毒理評價模式為我國創新藥研發提供了有力的安全性保障，並成功地為解決國內近幾年在臨床和上市後發生的肝素鈉、馬兜鈴酸等藥物不良反應事件提供有力技術支撐。

大量新技術和新方法的套用使毒理學研究水平更加深入,藥物的毒性評價將從目前的模式逐步發展到體外細胞、分子水平的毒性測試與人體志願者試驗相結合的新模式。相比國外藥物毒理學的發展現狀, 國內藥物毒理學在關鍵技術的建立與新技術新方法的套用等方面還有一定的差距,作為毒理學工作者, 需加強新模型套用、組學技術、生物標誌物等領域的研究力度, 提高我國創新藥物毒理學研究的水平, 為醫藥產業的健康發展奠定基礎, 最終為人類提供更安全、有效的藥物。