菌種在培養或保藏過程中，由於自發突變的存在，出現某些原有優良生產性狀的劣化、遺傳標記的丟失等現象，稱為菌種衰退。菌種衰退不是突然發生的，而是從量變到質變的逐步演變過程。菌種衰退的主要原因是有關基因的負突變。合理的育種、選用合適的培養基、創造良好的培養條件、採用有效的菌種保藏方法等可以有效的防止菌種的退化。常用的菌種保藏方法有斜面低溫保藏法、液體石蠟保藏法、濾紙保藏法、沙土保藏法、液氮冷凍保藏法、冷凍乾燥保藏法。
基本介紹
- 中文名：菌種衰退
- 外文名：degeneration
- 性質：細菌
- 特徵：原優良性狀的劣化或遺傳標記丟失
定義,過程,原因,有關基因發生負突變,表型延遲造成菌種衰退,質粒脫落導致菌種衰退,連續傳代,不適宜的培養和保藏條件,防止,合理的育種,選用合適的培養基,創造良好的培養條件,控制傳代次數,利用不同類型的細胞進行移種傳代,採用有效的菌種保藏方法,菌種的復壯,定義,措施,常用保藏方法,斜面低溫保藏法,液體石蠟保藏法,濾紙保藏法,砂土保藏法,液氮冷凍保藏法,冷凍乾燥保藏法,
定義
菌種在培養或保藏過程中，由於自發突變的存在，出現某些原有優良生產性狀的劣化、遺傳標記的丟失等現象，稱為菌種的衰退（degeneration）。
過程
菌種衰退不是突然發生的，而是從量變到質變的逐步演變過程。開始時，在群體細胞中僅有個別細胞發生自發突變（一般均為負變），不會使群體菌株性能發生改變。經過連續傳代，群體中的負變個體達到一定數量，發展成為優勢群體，從而使整個群體表現為嚴重的衰退。
原因
經分析發現，導致這一現象的原因有以下幾方面。
有關基因發生負突變
菌種衰退的主要原因是有關基因的負突變。如果控制產量的基因發生負突變，則表現為產量下降；如果控制孢子生成的基因發生負突變，則產生孢子的能力下降。菌種在移種傳代過程中會發生自發突變。雖然自發突變的幾率很低(一般為10-6～10-9)，尤其是對於某一特定基因來說，突變頻率更低。但是由於微生物具有極高的代謝繁殖能力，隨著傳代次數增加，衰退細胞的數目就會不斷增加，在數量上逐漸占優勢，最終成為一株衰退了的菌株。
表型延遲造成菌種衰退
表型延遲現象也會造成菌種衰退。如，在誘變育種過程中，經常會發現某菌株初篩時產量較高，進行復篩時產量卻下降了。
質粒脫落導致菌種衰退
質粒脫落導致菌種衰退的情況在抗生素生產中較多，不少抗生素的合成是受質粒控制的。當菌株細胞由於自發突變或外界條件影響（如高溫），致使控制產量的質粒脫落或者核內DNA和質粒複製不一致，即DNA複製速度超過質粒，經多次傳代後，某些細胞中就不具有對產量起決定作用的質粒，這類細胞數量不斷提高達到優勢，則菌種表現為衰退。
連續傳代
連續傳代是加速菌種衰退的一個重要原因。一方面，傳代次數越多，發生自發突變（尤其是負突變）的幾率越高；另一方面，傳代次數越多，群體中個別的衰退型細胞數量增加並占據優勢越快，致使群體表型出現衰退。
不適宜的培養和保藏條件
不適宜的培養和保藏條件是加速菌種衰退的另一個重要原因。不良的培養條件如營養成分、溫度、濕度、pH值、通氣量等和保藏條件如營養、含水量、溫度、氧氣等，不僅會誘發衰退型細胞的出現，還會促進衰退細胞迅速繁殖，在數量上大大超過正常細胞，造成菌種衰退。
防止
合理的育種
選育菌種時所處理的細胞應使用單核的，避免使用多核細胞；合理選擇誘變劑的種類和劑量或增加突變位點，以減少分離回復；在誘變處理後進行充分的後培養及分離純化，以保證保藏菌種純碎。這些可有效的防止菌種的退化。
選用合適的培養基
創造良好的培養條件
在生產實踐中，創造和發現一個適合原種生長的條件可以防止菌種退化，如低溫、乾燥、缺氧等。在棲土麴黴3.942 的培養中，有人曾用改變培養溫度的措施(從20－30℃提高到33－34℃)來防止它產孢子能力的退化。
控制傳代次數
由於微生物存在著自發突變，而突變都是在繁殖過程中發生而表現出來的。所以應儘量避免不必要的移種和傳代，把必要的傳代降低到最低水平，以降低自發突發的機率。菌種傳代次數越多，產生突變的幾率就越高，因而菌種發生退化的機會就越多。這要求不論在實驗室還是在生產實踐上，必須嚴格控制菌種的移種傳代次數，並根據菌種保藏方法的不同，確立恰當的移種傳代的時間間隔。如同時採用斜面保藏和其它的保藏方式（真空凍乾保藏、砂土管、液氮保藏等），以延長菌種保藏時間。
利用不同類型的細胞進行移種傳代
在有些微生物中，如放線菌和黴菌，由於其菌的細胞常含有幾個核或甚至是異核體，因此用菌絲接種就會出現不純和衰退，而孢子一般是單核的，用它接種時，就沒有這種現象發生。有人在實踐中發現構巢麴黴如用分生孢子傳代就容易退化，而改用子囊孢子移種傳代則不易退化；還有人採用滅過菌的棉團輕巧地沾取“5406”孢子進行斜面移種，由於避免了菌絲的接入，因而達到了防止退化的效果。
採用有效的菌種保藏方法
用於工業生產的一些微生物菌種，其主要性狀都屬於數量性狀，而這類性狀恰是最容易退化的。因此，有必要研究和制定出更有效的菌種保藏方法以防止菌種退化。
菌種的復壯
定義
菌種的復壯（rejuvenation）：使衰退的菌種恢復原來優良性狀。
狹義的復壯是指在菌種已發生衰退的情況下，通過純種分離和生產性能測定等方法，從衰退的群體中找出未衰退的個體，以達到恢復該菌原有典型性狀的措施；
廣義的復壯是指在菌種的生產性能未衰退前就有意識的經常、進行純種的分離和生產性能測定工作，以期菌種的生產性能逐步提高。實際上是利用自發突變（正變）不斷地從生產中選種。
措施
① 純種分離。採用平板劃線分離法、稀釋平板法或塗布法均可。把仍保持原有典型優良性狀的單細胞分離出來，經擴大培養恢復原菌株的典型優良性狀，若能進行性能測定則更好。還可用顯微鏡操縱器將生長良好的單細胞或單孢子分離出來，經培養恢復原菌株性狀。
② 通過寄主體內生長進行復壯（如Bacillus thuringiensis的復壯）。主要是對一些寄生性的菌株，可以將衰退的菌株接種到相應的宿主體內，提高其寄生性能及其它性能。
③ 淘汰已衰退的個體（採用比較激烈的理化條件進行處理，以殺死生命力較差的已衰退個體）。可以採用各種外界不良理化條件,使發生衰退的個體死亡,從而留下群體中生長健壯的個體.如:對"5406"抗生菌的分生孢子進行-30-10度的低溫處理5-7天,使80%死亡,在抗低溫個體中可找到健壯的個體.
④ 採用有效的菌種保藏方法。
常用保藏方法
菌種保藏的基本手段是採用千燥、低溫、冷凍或減少氧氣供給等方法來中止菌種繁殖，降低其代謝強度，使之處於休眠狀態。常用以下方法保藏菌種。
斜面低溫保藏法
將菌種接種在適宜的固體斜面培養基上，待菌充分生長後，棉塞部分用油紙包紮好，移至2－8℃的冰櫃中保藏。
保藏時間依微生物的種類而有不同，黴菌、放線菌及有芽孢的細菌保存2－4個月，移種一次。酵母菌兩個月，細菌最好每月移種一次。
此法為實驗室和工廠菌種室常用的保藏法，優點是操作簡單，使用方便，不需特殊設備，能隨時檢查所保藏的菌株是否死亡、變異與污染雜菌等。缺點是容易變異，因為培養基的物理、化學特性不是嚴格恆定的，屢次傳代會使微生物的代謝改變，而影響微生物的性狀；污染雜菌的機會亦較多。
液體石蠟保藏法
（1）將液體石蠟分裝於三角燒瓶內，塞上棉塞，並用牛皮紙包紮，1.05kg/cm2>，121.3℃滅菌30分鐘，然後放在40℃溫箱中，使水汽蒸發掉，備用。
（2）將需要保藏的菌種，在最適宜的斜面培養基中培養，使得到健壯的菌體或孢子。
（3）用滅菌吸管吸取滅菌的液體石蠟，注入已長好菌的斜面上，其用量以高出斜面頂端1cm為準（圖Ⅶ-12），使菌種與空氣隔絕。
（4）將試管直立，置低溫或室溫下保存（有的微生物在室溫下比冰櫃中保存的時間還要長）。
此法實用而效果好。黴菌、放線菌、芽孢細菌可保藏2年以上不死，酵母菌可保藏1－2年，一般無芽孢細菌也可保藏1年左右，甚至用一般方法很難保藏的腦膜炎球菌，在37℃溫箱內，亦可保藏3個月之久。此法的優點是製作簡單，不需特殊設備，且不需經常移種。缺點是保存時必須直立放置，所占位置較大，同時也不便攜帶。從液體石蠟下面取培養物移種後，接種環在火焰上燒灼時，培養物容易與殘留的液體石蠟一起飛濺，應特別注意。
濾紙保藏法
（1）將濾紙剪成0.5×1.2cm的小條，裝入0.6×8cm的安瓿管中，每管1－2張，塞以棉塞，1.05kg/cm2>，121.3℃滅菌30分鐘。
（2）將需要保存的菌種，在適宜的斜面培養基上培養，使充分生長。
（3）取滅菌脫脂牛乳1－2ml滴加在滅菌培養皿或試管內，取數環菌苔在牛乳內混勻，製成濃懸液。
（4）用滅菌鑷子自安瓿管取濾紙條浸入菌懸液內，使其吸飽，再放回至安瓿管中，塞上棉塞。
（5）將安瓿管放入內有五氧化二磷作吸水劑的乾燥器中，用真空泵抽氣至乾。
（6）將棉花塞入管內，用火焰按圖Ⅶ-13熔封，保存於低溫下。
（7）需要使用菌種，復活培養時，可將安瓿管口在火焰上燒熱，滴一滴冷水在燒熱的部位，使玻璃破裂，再用鑷子敲掉口端的玻璃，待安瓿管開啟後，取出濾紙，放入液體培養基內，置溫箱中培養。
細菌、酵母菌、絲狀真菌均可用此法保藏，前兩者可保藏2年左右，有些絲狀真菌甚至可保藏14－17年之久。此法較液氮、冷凍乾燥法簡便，不需要特殊設備。
砂土保藏法
（1）取河沙加入10%稀鹽酸，加熱煮沸30分鐘，以去除其中的有機質。
（2）倒去酸水，用自來水沖洗至中性。
（3）烘乾，用40目篩子過篩，以去掉粗顆粒，備用。
（4）另取非耕作層的不含腐植質的瘦黃土或紅土，加自來水浸泡洗滌數次，直至中性。
（5）烘乾，碾碎，通過100目篩子過篩，以去除粗顆粒。
（6）按一份黃土、三份沙的比例（或根據需要而用其他比例，甚至可全部用沙或全部用土）摻合均勻，裝入10×100mm的小試管或安瓿管中，每管裝1g左右，塞上棉塞，進行滅菌，烘乾。
（7）抽樣進行無菌檢查，每10支沙土管抽一支，將沙土倒入肉湯培養基中，37℃培養48小時，若仍有雜菌，則需全部重新滅菌，再作無菌試驗，直至證明無菌，方可備用。
（8）選擇培養成熟的（一般指孢子層生長豐滿的，營養細胞用此法效果不好）優良菌種，以無菌水洗下，製成孢子懸液。
（9）於每支沙土管中加入約0.5ml（一般以剛剛使沙土潤濕為宜）孢子懸液，以接種針拌勻。
（10）放入真空乾燥器內，用真空泵抽乾水分，抽乾時間越短越好，務使在12小時內抽乾。
（11）每10支抽取一支，用接種環取出少數沙粒，接種於斜面培養基上，進行培養，觀察生長情況和有無雜菌生長，如出現雜菌或菌落數很少或根本不長，則說明製作的沙土管有問題，尚須進一步抽樣檢查。
（12）若經檢查沒有問題，用火焰熔封管口，放冰櫃或室內乾燥處保存。每半年檢查一次活力和雜菌情況。
（13）需要使用菌種，復活培養時，取沙土少許移入液體培養基內，置溫箱中培養。
此法多用於能產生孢子的微生物如黴菌、放線菌，因此在抗生素工業生產中套用最廣，效果亦好，可保存2年左右，但套用於營養細胞效果不佳。
液氮冷凍保藏法
（1）準備安瓿管用於液氮保藏的安瓿管，要求能耐受溫度突然變化而不致破裂，因此，需要採用硼矽酸鹽玻璃製造的安瓿管，安瓿管的大小通常使用75×10mm的，或能容1.2mm液體的。
（2）加保護劑與滅菌保存細菌、酵母菌或黴菌孢子等容易分散的細胞時，則將空安瓿管塞上棉塞，1．05kg/cm2，121.3℃滅菌15分鐘：若作保存黴菌菌絲體用則需在安瓿管內預先加入保護劑如10%的甘油蒸餾水溶液或10%二甲亞碸蒸餾水溶液，加入量以能浸沒以後加入的菌落圓塊為限，而後再用1.05kg/cm2>，121.3℃滅菌15分鐘。
（3）接入菌種將菌種用10%的甘油蒸餾水溶液製成菌懸液，裝入已滅菌的安瓿管；黴菌菌絲體則可用滅菌打孔器，從平板內切取菌落圓塊，放入含有保護劑的安瓿管內，然後用火焰熔封。浸入水中檢查有無漏洞。
（4）凍結再將已封口的安瓿管以每分鐘下降1℃的慢速凍結至-30℃。若細胞急劇冷凍，則在細胞內會形成凍的結晶，因而降低存活率。
（5）保藏經凍結至-30℃的安瓿管立即放入液氮冷凍保藏器（圖Ⅶ-14）的小圓筒內，然後再將小圓筒放入液氮保藏器內。液氮保藏器內的氣相為-150℃，液態氮內為-196℃。
（6）恢復培養保藏的菌種需要用時，將安瓿管取出，立即放入38－40℃的水浴中進行急劇解凍，直到全部融化為止。再打開安瓿管，將內容物移入適宜的培養基上培養。
此法除適宜於一般微生物的保藏外，對一些用冷凍乾燥法都難以保存的微生物如支原體、衣原體、氫細菌、難以形成孢子的黴菌、噬菌體及動物細胞均可長期保藏，而且性狀不變異。缺點是需要特殊設備。
冷凍乾燥保藏法
（1）準備安瓿管用於冷凍乾燥菌種保藏的安瓿管宜採用中性玻璃製造，形狀可用長頸球形底的，亦稱淚滴型安瓿管（圖Ⅶ-15），大小要求外徑6－7.5mm，長105mm，球部直徑9－11mm，壁厚0.6－1.2mm。也可用沒有球部的管狀安瓿管。塞好棉塞，1.05kg/cm2>，121.3℃滅菌30分鐘，備用。
（2）準備菌種，用冷凍乾燥法保藏的菌種，其保藏期可達數年至十數年，為了在許多年後不出差錯，故所用菌種要特別注意其純度，即不能有雜菌污染，然後在最適培養基中用最適溫度培養，使培養出良好的培養物。細菌和酵母的菌齡要求超過對數生長期，若用對數生長期的菌種進行保藏，其存活率反而降低。一般，細菌要求24－48小時的培養物；酵母需培養3天；形成孢子的微生物則宜保存孢子；放線菌與絲狀真菌則培養7－10天。
（3）製備菌懸液與分裝以細菌斜面為例，用脫脂牛乳2ml左右加入斜面試管中，製成濃菌液，每支安瓿管分裝0.2ml。
（4）冷凍冷凍乾燥器有成套的裝置出售，價值昂貴，此處介紹的是簡易方法與裝置，可達到同樣的目的。
將分裝好的安瓿管放低溫冰櫃中冷凍，無低溫冰櫃可用冷凍劑如乾冰（固體CO2>）酒精液或乾冰丙酮液，溫度可達-70℃。將安瓿管插入冷凍劑，只需冷凍4－5分鐘，即可使懸液結冰。
（5）真空乾燥為在真空乾燥時使樣品保持凍結狀態，需準備冷凍槽，槽內放碎冰塊與食鹽，混合均勻，可冷至-15℃。裝置儀器如圖Ⅶ-16，安瓿管放入冷凍槽中的乾燥瓶內。
抽氣一般若在30分鐘內能達到93.3Pa（0.7mmHg）真空度時，則乾燥物不致熔化，以後再繼續抽氣，幾小時內，肉眼可觀察到被乾燥物已趨乾燥，一般抽到真空度26．7Pa（0.2mmHg），保持壓力6－8小時即可。
（6）封口抽真空乾燥後，取出安瓿管，接在封口用的玻璃管上，可用L形五通管（圖Ⅶ-17）繼續抽氣，約10分鐘即可達到26.7Pa（0.2mmHg）。於真空狀態下，以煤氣噴燈的細火焰在安瓿管頸中央進行封口。封口以後，保存於冰櫃或室溫暗處。
此法為菌種保藏方法中最有效的方法之一，對一般生活力強的微生物及其孢子以及無芽胞菌都適用，即使對一些很難保存的致病菌，如腦膜炎球菌與淋病球菌等亦能保存。適用於菌種長期保存，一般可保存數年至十餘年，但設備和操作都比較複雜。
