苯並芘的免疫學快速檢測技術研究

論文摘要

苯並芘又稱3,4-苯並芘，縮寫為BaP，是世界公認的三大致癌物質之一，其在環境中存在廣泛，工業生產和生活過程中煤炭、石油和天然氣等燃料不完全燃燒產生的廢氣以及食物在熏制、烘烤和煎炸等高溫烹調過程中都會產生。苯並芘的毒性具有長期和隱匿的特性，當人體接觸或攝入苯並芘後即便當時沒有不適反應，但也會在體內蓄積。在表現出症狀前有較長的潛伏期，一般為20~25年，同時也會使子孫後代受到影響。苯並芘還具有致癌性、致畸性和致突變性，它能夠引起肺癌、胃癌、膀胱癌及消化道癌等多種癌症，還能通過母體經胎盤影響子代，從而引起胚胎畸形或死亡以及幼仔免疫功能下降等。由於苯並芘來源廣泛，其危害性又比較大，因此建立快速簡便的苯並芘檢測方法極為必要。本研究首先對苯並芘的結構進行化學改造，引入氨基後，成功合成了人工抗原（BSA-oABaP）和包被抗原（OVA-oABaP），用BSA-oABaP免疫BALB/c純系雄性小鼠，製得了高效價的苯並芘多克隆抗體（BaP pAb），經細胞融合，建立雜交瘤細胞系製得了苯並芘單克隆抗體（BaP mAb），組裝了苯並芘快速檢測ELISA試劑盒，確立了最佳工作步驟，並對試劑盒性能進行了確證。主要研究內容如下：1、以BaP為原料，經硝化和還原引入氨基合成半抗原（oABaP），再採用碳化二亞胺（EDC）法將半抗原分別與牛血清白蛋白（BSA）及卵清蛋白（OVA）偶聯，合成人工抗原（BSA-oABaP）和包被抗原（OVA-oABaP）；通過紫外掃描（UV）法和聚丙醯胺凝膠電泳（SDS-PAGE）法進行鑑定；免疫BALB/c雄性小鼠，採用間接ELISA法測定小鼠多抗血清效價、阻斷ELISA法測定抑制價。結果表明：紫外掃描結果顯示BSA-oABaP的波峰發生右移，說明偶聯成功；SDS-PAGE分析表明，BSA-oABaP泳動速度小於BSA，進一步說明偶聯成功；免疫的六隻小鼠血清抗體的效價均超過1:103，血清效價最高的是6號小鼠，半數抑制濃度IC50為22.14μg/L，抗體與結構相似的苯並[b]熒蒽的交叉反應率為18%，與其它化合物交叉反應率均在0.05%以下，表明獲得了具有良好特異性的BaPpAb.2、用BSA-oABaP免疫BALB/c小鼠，通過間接ELISA法和阻斷ELISA法，選擇一隻效價和抑制價均較好的小鼠作為融合備用鼠，套用細胞融合技術篩選出1D3、2A9、2E12共三株敏感特異的雜交瘤細胞，用體內誘生腹水法製備大量的苯並芘單克隆抗體（BaPmAb），經鑑定，其細胞培養上清的效價為1:3.2×102、1:5.12×102、1:6.4×102，腹水效價為1:2.56×105、1:5.0×105、1:5.12×105，腹水的IC50為1.413μg/L、1.156μg/L、0.923μg/L，親和常數(Ka)為2.36×109L/mol、3.84×109L/mol、1.81×1010L/mol，檢測亞型均為IgG1型，抗體與結構相似的苯並[b]熒蒽的交叉反應率為3.3%，與其它化合物交叉反應率均在0.05%以下，表明成功製得了具有良好特異性的BaP mAb。3、套用已製備的BaP mAb研製出苯並芘快速檢測ELISA試劑盒（BaP-Kit）。BaP-Kit的標準曲線呈S型，符合檢測線性要求，線性回歸方程為y=-28.662x+132.87，R2=0.9902，IC50=0.779μg/L。BaP-Kit的靈敏度為0.054μg/L，在牛肉和豬肉樣品中添加苯並芘標準品，平均添加回收率分別為90.05%、86.97%，平均批內和批間變異係數均小於6%，BaP-Kit與結構相似的苯並[b]熒蒽的交叉反應率為2.7%，與其它化合物交叉反應率均在0.05%以下，在4℃保存四個月後，其特異性基本無變化。

苯並芘的免疫學快速檢測技術研究

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