《苯並噻吩類含硫化合物單加氧酶的底物識別機制研究》是依託南開大學，由李國強擔任項目負責人的青年科學基金項目。
基本介紹
- 中文名：苯並噻吩類含硫化合物單加氧酶的底物識別機制研究
- 項目類別：青年科學基金項目
- 項目負責人：李國強
- 依託單位：南開大學
中文摘要,結題摘要,
中文摘要
燃油中含硫化合物的燃燒是造成環境污染的重要原因之一。採用生物脫硫工藝可以在較溫和的條件下脫除傳統加氫脫硫工藝難以脫除的大分子含硫化合物（苯並噻吩及其衍生物，BTs；二苯並噻吩及其衍生物，DBTs）中的有機硫。目前篩選到的菌株大都只能高效地脫除BTs或DBTs中的有機硫；現有的研究表明在苯並噻吩類含硫化合物的4S生物脫硫途徑中，催化前兩步反應的單加氧酶（BT單加氧酶或DBT單加氧酶）在菌株的底物識別過程中起著關鍵作用，但尚未見這兩種單加氧酶類似蛋白結構及底物識別機制的相關報導。生物催化劑的底物識別範圍和催化活性是決定生物脫硫工藝能否商業化套用的關鍵因素。本項目擬通過對這兩種單加氧酶的結構解析、關鍵胺基酸的定點突變等研究內容闡明生物脫硫酶底物識別的分子機制，為生物脫硫菌株的遺傳改良奠定基礎，並期望在此基礎上通過對單加氧酶的遺傳改良拓寬菌株利用含硫化合物的底物範圍。
結題摘要
微生物可以在較溫和的條件下脫除燃油中含硫雜環化合物的有機硫，而不損失其熱值。但目前所篩選到的菌株多數只能高效脫除二苯並噻吩（DBT）或苯並噻吩（BT）中的有機硫，很難兩者兼顧。因此，闡明苯並噻吩類含硫化合物單加氧酶的底物識別機制對於利用基因工程手段拓寬其底物識別範圍具有重要意義。本項目通過解析DBT單加氧酶及其與輔酶複合物的晶體結構確定了該酶的底物識別與催化活性中心；通過BT高效脫硫菌株Gordonia sp. C-6的比較轉錄組分析、基因組分析及體外酶活分析確定了菌株C-6中BT生物脫硫的代謝機制；並構建了能夠同時識別並催化BT和DBT脫硫的基因工程菌株。具體成果如下：（1）成功獲得了DBT單加氧酶（DszC）及DszC-FMN的晶體結構。發現DszC以四聚體的形式存在，其C端的無規則捲曲在維持蛋白的聚合形式和蛋白活性中起著重要作用。確定了由Tyr96、 Asn129、Phe161、 Ser163、Trp205、Ser215、Phe250、His391等胺基酸組成的活性中心，其中FMN、Tyr96、 Asn129和Phe250對於DBT在活性中心的正確定位起著關鍵作用。但在這些胺基酸的定點突變庫中並未檢測出能夠識別並催化BT的突變。（2）鑒於關鍵胺基酸的定點突變並未使DszC獲得識別並催化BT的能力，且尚未見到BT脫硫酶的報導。我們對Gordonia sp. C-6在以BT或Na2SO4為唯一硫源培養條件下的轉錄組進行了分析。與Na2SO4為硫源相比，在以BT為硫源時菌株C-6中表達水平上調的基因有135個。通過基因組分析，進一步發現有3個表達水平上調的基因構成了一個操縱子，它們的編碼產物分別為苯磺酸鹽水解酶、FMNH2依賴型單加氧酶和烷基磺酸鹽單加氧酶。將該操縱子在E. coli Rosetta中表達後用全細胞破碎液作用BT，在其乙酸乙酯抽提物中檢測到了剩餘的BT和BT的脫硫產物鄰羥基苯乙烯，從而確定了菌株C-6中BT的脫硫機制。（3）雖然BTs和DBTs有著相似的脫硫途徑，但催化這兩種化合物脫硫的酶之間進化關係較遠，難以通過基因工程的辦法拓寬其底物識別範圍。為此，我們將BT脫硫酶基因在DBT脫硫菌株中進行了表達，從而構建了噻吩類含硫化合物高效脫硫基因工程菌。利用該工程菌可以同時脫除市售柴油中苯並噻吩、二苯並噻吩及它們衍生物中的有機硫，其脫硫率為97%以上。
