自噬及其調控在急性腦梗死發病機制中的作用

《自噬及其調控在急性腦梗死發病機制中的作用》是依託上海交通大學，由孫曉江擔任項目負責人的面上項目。

基本介紹

• 中文名：自噬及其調控在急性腦梗死發病機制中的作用
• 項目類別：面上項目
• 項目負責人：孫曉江
• 依託單位：上海交通大學

項目摘要

缺血性損傷過程中，神經細胞的存活與缺血時間密切相關。神經細胞對缺血損害非常敏感，缺血性損傷後，神經細胞自噬水平隨著缺血時間的不同而發生變化。我們利用氧糖剝奪海馬神經元細胞模型和大鼠永久性大腦中動脈梗塞模型，觀察急性腦梗死後的組織損傷和修復過程中不同時間點神經細胞的自噬水平，主要包括透射電鏡觀察自噬小體、自噬溶酶體、線粒體、內織網結構等細胞超微結構的變化, 採用免疫印跡法檢測LC3、TOR、beclin-1、Caspase-3、ATG5、ATG8等蛋白的表達水平，首先明確在急性腦梗死的不同階段，神經細胞活性、形態的變化與自噬的關係; 其次利用小RNA沉默技術干擾beclin-1途徑，觀察自噬相關蛋白的表達與缺血損傷的關係；為進一步揭示自噬調控的機制，還利用膜片鉗等技術檢測技術檢測急性腦梗死後不同時間點細胞膜的通透性、線粒體膜電位以及Ca2+等，為腦梗塞的治療提供新的理論依據和可能思路。

結題摘要

背景：自噬通過回收再利用蛋白質和受損細胞器來維持細胞內環境穩定，在大多數情況下自噬被認為是促進細胞存活的。至今，越來越多的證據表明自噬參與腦缺血損傷的病理過程。然而，在腦缺血損傷中自噬究竟是起一種內源性保護機制，還是恰恰相反導致細胞死亡，目前尚有爭論。最近，有研究認為缺血損傷時自噬過程的受損而不是過度自噬致使細胞死亡。缺血後處理(ischemic postconditioning，IpostC)是指在腦缺血再灌注（ischemia/reperfusion ，I/R）時予以短暫的缺血干預，已被證實能產生多種內源性保護作用，減輕腦缺血再灌注損傷。而自噬在腦缺血後處理的病理過程中起什麼作用，是否不同於腦缺血再灌注？目前少有研究，我們預測自噬在兩者中可能起不同作用。 目的：本研究通過大鼠局部腦缺血再灌注及缺血後處理模型來證實缺血後處理的神經保護作用，同時探索自噬在這過程中的作用及其機制。 方法：使用線栓方法建立大鼠大腦中動脈缺血再灌注模型（I/R），在大腦中動脈閉塞100分鐘後移去線栓恢復動脈血流；缺血後處理（IpostC）則是在血流恢復10分鐘後再次插入線栓閉塞大腦中動脈，再次阻斷血流10分鐘後移去線栓恢復動脈血流。為評估自噬在缺血後處理中的作用，自噬抑制劑3MA在再灌注前30分鐘經顱注射入大鼠局部腦缺血側側腦室（IpostC+3MA）。實驗中成年SD大鼠分為5組：對照組（sham），腦缺血再灌注組（I/R），腦缺血後處理組(IpostC)，腦缺血後處理+3MA(IpostC+3MA)組及腦缺血後處理+Veh組（IpostC+3MA的對照組）。缺血24小時後採用mNSS評分評估大鼠神經損傷程度，取腦做焦油紫染色評估梗死面積。進一步通過Western blot 和免疫組化檢測自噬相關蛋白；透射電子顯微鏡檢測自噬體、自噬溶酶體和線粒體的數目、形態變化；TUNEL分析皮層神經元凋亡。 結果：與I/R組相比，IpostC組減少腦梗死面積將近40%，神經功能評分改善（p＜0.05），而3MA干預後腦梗死面積和神經功能評分沒改善。Western blot 、免疫組化和透射電子顯微鏡檢測顯示在I/R和IpostC+veh組均有自噬體形成增多(P＜0.05 vs sham)，而IpostC+3MA抑制了自噬體的形成。在I/R組，LC3-II/LC3-I、beclin-1、p62表達增高，