《腺伴病毒介導的hTRX-PR39融合基因表達對腦缺血的保護作用》是依託山東大學，由阮喜雲擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：腺伴病毒介導的hTRX-PR39融合基因表達對腦缺血的保護作用
- 項目類別：面上項目
- 項目負責人：阮喜雲
- 依託單位：山東大學
中文摘要,結題摘要,
中文摘要
本課題根據近年來腦缺血後組織修復的細胞學和分子生物研究進展，設計了HRE（低氧反應元件）調控的分泌表達血管生成的總開關－PR39與人硫氧還蛋白hTRX融合表達的重組腺相關病毒,通過介入方式轉導有腦缺血傾向的腦組織和血管。目的是希望在腦缺氧和梗塞發生早期能起動PR39的分泌表達，通過它特異的抑制泛素-蛋白酶體對HIF-1α的降解，來增加血管形成的細胞因子和受體（VEGF、KDR、FLT-1和FGF-1 ）長期持續性高表達，實現腦缺氧和梗塞發生後的早期神經元修復和血管再建，也通過PR39具有的抗炎症反應、抗缺血缺氧應激凋亡作用，人硫氧還蛋白的抗氧化、抗細胞凋亡、保護缺血再灌注損傷等，保護受損害神經細胞的存活和功能。本課題是探討使用基因治療方法，通過控制血管形成因子轉錄的上游元件來實現預防和治療急性腦梗死以及腦功能的再建，它將為缺血性腦血管病的預防和治療尋找新的理論。
結題摘要
目的 ：構建腺相關病毒（AAV）介導的融和基因hTRX-PR39，探討其對低氧ECV304、缺氧雞胚、腦缺血缺氧大鼠的神經保護和血管保護作用。方法：1、套用雙酶切法構建了pGEM-T-hTRX-PR39載體。2、酶切上載體獲取hTRX-PR39融合基因，將其插入pSSCMV病毒載體質粒中，得到重組腺相關病毒載體質粒。3、套用三質粒磷酸鈣共沉澱法獲得hTRX-PR39重組腺相關病毒載體, 斑點雜交（Dot blot）法測定病毒滴度。4、免疫細胞化學檢測hTRX表達情況5、套用台盼藍染色法進行活細胞計數6、流式細胞儀檢測低氧環境下ECV304細胞凋亡情況。7、定量PCR檢測儀檢測ECV304中VEGF-A, VEGFR-1, VEGFR-2, FGFR-1, Syndecan-4及PR39的表達水平。8、圖象軟體Image Pro Plus （IPP）分析缺氧雞胚尿膜囊（CAM）血管密度。9、套用免疫組化以及微血管密度計數、電鏡觀察大鼠腦缺血周邊區血管生成的情況10、RT-PCR檢測hTRX-PR39mRNA的結果相關性；Western Blotting對腦缺血組織中的HIF-1、VEGF的半定量。結果： 1．構建了重組腺相關病毒質粒pSSCMV/ hTRX-PR39，Dot blot法測定重組病毒滴度高。2．免疫細胞化學檢測到重組hTRX -PR39的AAV載體在ECV304中進行表達3．定量PCR檢測到AAV- hTRX -PR39可提高缺氧ECV304中VEGF-A, VEGFR-1, VEGFR-2, FGFR-1, Syndecan-4及PR39的表達水平，明顯高於PBS組（P＜0.001）。4．流式細胞儀分析低氧環境下ECV304細胞周期圖，實驗組ECV304中凋亡率明顯小於PBS組。5．低氧環境下，治療組的雞胚尿膜囊血管密度明顯大於PBS組。常氧環境下，血管密度無明顯差別。6.AAV- hTRX -PR39治療組大鼠腦缺血周邊區CD34表達明顯高於對照組；腦缺血組織中的HIF-1、VEGF表達明顯高於對照組。結論：1.成功構建了pSSCMV/ hTRX-PR39，包裝較高濃度的重組病毒。2.hTRX -PR39對低氧ECV304、缺氧雞胚、腦缺血缺氧大鼠具有抗缺氧應激細胞凋亡和促血管生成雙重保護作用。
