《脫敏態GluA2配體結合域LBD二聚體系綜結構及其調控的研究》是依託浙江大學，由劉主擔任項目負責人的青年科學基金項目。
基本介紹
- 中文名：脫敏態GluA2配體結合域LBD二聚體系綜結構及其調控的研究
- 依託單位：浙江大學
- 項目負責人：劉主
- 項目類別：青年科學基金項目
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
研究蛋白質系綜結構及分布比例使我們了解蛋白質如何行使功能。離子型谷氨酸受體2（GluA2）參與腦內重要的生理和病理過程。研究表明，GluA2為二聚—二聚組成的四聚體，其配體結合域（LBD）二聚體結構的變化對GluA2的配體門控至關重要。由於GluA2的LBD二聚作用極弱（KD值約為6mM），因此對其結構研究極少。最近我們實驗發現，在脫敏條件下，LBD的瞬態二聚體存在多種構象。為解析脫敏態LBD二聚體原子解析度的系綜結構及分布比例，本項目擬採用化學交聯質譜分析的方法獲得低解析度的系綜構象和分布，同時運用順磁弛豫增強的液體核磁共振技術解析原子分辨的系綜結構，並聯合小角X光散射以計算各構象比例。基於LBD二聚體的結構，我們將突變界面關鍵位點，結合電生理，闡明全長GluA2脫敏過程與脫敏態LBD二聚體系綜結構的構效關係。據此，我們將從脫敏態LBD二聚體結構動態變化的角度揭示GluA2的脫敏機制。
結題摘要
離子型谷氨酸受體2（GluA2）參與腦內重要的生理和病理過程。研究表明，GluA2為二聚—二聚組成的四聚體，其配體結合域（LBD）二聚體結構的變化對GluA2的配體門控至關重要。由於GluA2的LBD二聚作用極弱（KD值約為6mM），對其結構研究極少，因此，本項目旨在解析脫敏態GluA2配體結合域LBD二聚體的系綜結構。本項目中，我們通過發展、整合順磁核磁共振（PRE-NMR）、單分子螢光（smFRET）、化學交聯質譜分析（CXMS）、小角X光散射（SAXS）等技術，對LBD二聚體的系綜結構進行了研究，具體進展和成果如下： 1、獲得了高量表達、穩定的LBD樣品，運用順磁核磁共振對其二聚體系綜結構進行了解析。通過最佳化原核表達系統，我們可獲得可溶表達，產量高達6mg/L表達菌。同時，我們採用包涵體表達、結合變復性的方法，獲得了高量表達且穩定的同位素標記樣品（15N、13C），並進行了核磁共振實驗，結果表明LBD具有完整的三維結構。基於此，我們採集了LBD的三維核磁共振信號、完成了化學位移歸屬；實現了順磁探針標記，並採集LBD分子間的順磁核磁共振數據（PREs），進行了LBD二聚體的系綜結構計算。 2、發展了多種適用於蛋白質動態結構研究的新方法。為了更全面的表征LBD二聚體的系綜結構，除了採用順磁核磁共振技術，我們還發展了諸如化學交聯質譜分析（CXMS）、小角X光散射（SAXS）、單分子螢光技術（smFRET）等生物物理手段，以期全面的表征LBD二聚體系綜結構的分布和比例。採用SAXS技術，我們解析了多個重要蛋白質的結構；我們以K63-diUb為模型蛋白，通過整合化學交聯質譜分析（CXMS）、小角X光散射（SAXS）與單分子螢光技術（smFRET）數據，整合系綜和單分子的信息，可以解析蛋白質更加精細的系綜結構。 通過本項目的實施，我們一方面表征了LBD二聚體的系綜結構，揭示了GluA2的脫敏機制，另一方面發展了蛋白質系綜結構的解析方法，可以用於其它結構動態的蛋白體系的研究。
