胚胎幹細胞關鍵因子Oct4和Nanog的RNA結合蛋白的鑑定和研究

《胚胎幹細胞關鍵因子Oct4和Nanog的RNA結合蛋白的鑑定和研究》是依託上海交通大學，由薛燕擔任項目負責人的青年科學基金項目。

基本介紹

• 中文名：胚胎幹細胞關鍵因子Oct4和Nanog的RNA結合蛋白的鑑定和研究
• 項目類別：青年科學基金項目
• 項目負責人：薛燕
• 依託單位：上海交通大學

項目摘要

Oct4和Nanog是兩種維持胚胎幹細胞全能性和自我更新的關鍵轉錄因子，其表達水平高低直接決定胚胎幹細胞的命運；而RNA結合蛋白是轉錄後水平基因表達調控的主要承擔者。為探討轉錄後Oct4和Nanog的表達調控機制，本項目擬採用肽核酸輔助的RNA結合蛋白鑑定技術（PAIR）及多維高效液相色譜、高通量生物質譜等儀器，重點實現活體內（in vivo）小鼠胚胎幹細胞不同狀態的Oct4和Nanog的RNA結合蛋白的鑑定。在此研究基礎上，運用免疫沉澱、RT-PCR、免疫細胞化學、改良的電泳遷移和RNA干擾等實驗手段對候選RNA結合蛋白進行進一步的驗證和功能研究。期望通過本項目的探索研究，發現調控Oct4和Nanog翻譯的關鍵蛋白，進一步揭示胚胎幹細胞全能性和自我更新的作用機理。

結題摘要

Oct4和Nanog是兩種維持胚胎幹細胞（ES）全能性和自我更新的關鍵轉錄因子，其表達水平高低直接決定胚胎幹細胞的命運；而RNA結合蛋白（RBPs）是轉錄後水平基因表達調控的主要承擔者，目前未見有文獻報導Oct4和Nanog的RNA結合蛋白。為探討轉錄後Oct4和Nanog的表達調控機制，本課題採用鏈黴素標籤、多維高效液相色譜、高通量生物質譜等儀器和手段實現了小鼠胚胎幹細胞Oct4和Nanog的RNA結合蛋白的鑑定，獲得了非冗餘候選RNA結合蛋白20多個。在此研究基礎上，運用RNA結合蛋白免疫沉澱（RIP）、免疫印跡（Western Blotting）、RT-PCR等實驗手段對候選RNA結合蛋白進行了多種方法的驗證，並對其中兩個非常重要的RNA結合蛋白（數據未發表，出於保密以RBP1和RBP2替代）進行了功能研究。RNA干擾實驗證明，降低RBP1和RBP2的表達時，ES細胞的多潛能因子，如Oct4、Nanog、Sox2和Cldn6的表達均出現了明顯的下降，對分化的細胞進行深入的研究發現，小鼠ES細胞主要向中胚層和內胚層分化。與RBP1和RBP2類似，RBP3是鑑定得到的一個Nanog的RNA 結合蛋白，在胚胎髮育過程中一直表達，是Lin28mRNA伴侶的翻譯抑制因子。在研究中發現，其相互作用的蛋白Cldn6是ES細胞的一個新型表面標誌物。作為幹細胞表面分選標記，可將畸胎瘤中未分化的幹細胞分離出來，經體外幹細胞培養條件培養，可形成典型的幹細胞克隆，有望成為通適的特異性幹細胞表面標誌。除此之外，我們還套用基因晶片技術考察了Oct4不同表達狀態下ES細胞的基因表達譜，並進行了生物信息學分析。結果顯示，上調Oct4的表達，有187個基因發生了明顯的變化；下調Oct4的表達，有304個基因發生了明顯的變化，主要參與的生物學活動有炎症應答、細胞形態改變、轉錄後修飾、蛋白摺疊等。綜上所述，通過ES關鍵因子Oct4和Nanog RNA結合蛋白的研究，我們找到了影響Oct4和Nanog轉錄、翻譯的一些重要蛋白質，這些蛋白質直接影響ES細胞的多潛能因子的表達，進而影響ES細胞的多潛能特性和分化趨勢，為進一步揭示胚胎幹細胞全能性和自我更新的作用機理提供了理論依據。