《聚合酶螺旋反應恆溫擴增核酸的方法及其套用》是依託中國人民解放軍軍事科學院軍事醫學研究院，由劉威擔任項目負責人的青年科學基金項目。
基本介紹
- 中文名：聚合酶螺旋反應恆溫擴增核酸的方法及其套用
- 項目類別：青年科學基金項目
- 項目負責人：劉威
- 依託單位：中國人民解放軍軍事科學院軍事醫學研究院
中文摘要,結題摘要,
中文摘要
我們發明了一種全新的核酸恆溫擴增方法，即聚合酶螺旋反應，這種方法通過在兩條引物的5’端加上一段互為反向的序列，可以使引物以自我為模板採用自螺旋擴增的方式將目標核酸片段大量擴增出來。我們以NDM-1基因為靶基因設計兩條引物，在63℃保溫90分鐘便可以完成擴增反應；如果再輔以兩條加速引物則恆溫擴增反應在30分鐘內變可以擴增完成，反應結果可以通過電泳、觀察濁度、產物染色等方式來判斷。聚合酶螺旋反應除了具備其他恆溫擴增簡單、快速、方便、敏感、特異等優點之外，還具有自身的特點，其引物設計簡單，和PCR引物設計基本一致；由於設計引物所需的靶序列較短，所以對靶序列的要求大大降低，尤其適用於病毒的檢測；可以通過間接的方法使反應結果肉眼可見，尤其適用於臨床的床旁檢測和疾控單位的現場快速檢測。我們在初步取得進展後尚需在聚合酶螺旋反應的反應模型，反應體系，引物設計原則，加速原理，結果判讀方式等方面開展研究。
結題摘要
我們發明了聚合酶螺旋反應(Polymerase Spiral Reaction, PSR)這一新型的核酸恆溫擴增方法，它利用混合引物的設計思路，採用Bst DNA聚合酶的鏈置換活性及其擴增體系，通過引物結合、延伸、解鏈、單鏈旋轉、再次延伸的循環，達到等溫條件下核酸擴增的目的，PSR兼具PCR法引物設計簡單和LAMP法只需一種酶、反應高效的特點，首次實現了一對引物和一種酶在等溫環境下的核酸擴增。為進一步提高PSR法的反應速率，我們引入了加速引物的概念，通過添加加速引物可使得反應Ct值縮小到20min之內，在30min左右即可完成反應。此外，本研究採用了液體和固體封閉劑解決反應中可能存在的氣溶膠污染問題，並最佳化了反應體系和引物設計參數，最終建立聚合酶螺旋反應這一新型的核酸恆溫擴增方法。 本研究還構建了肺炎克雷伯菌、白色念珠菌、銅綠假單胞菌、腸道病毒71型、柯薩奇病毒A16型、霍亂弧菌這六種病原微生物的PSR檢測方法，實驗評估證實其具有良好的特異性和敏感性，並在臨床考核中取得了良好成效。 綜上所述，本研究發明了聚合酶螺旋反應這一新型的核酸恆溫擴增方法，具有良好的特異性與敏感性；解決了樣本核酸提取和擴增結果判斷繁瑣、複雜的問題；建立了基於PSR反應的快速檢測技術平台。我們認為PSR技術將為即時檢測、應對新發突發傳染病疫情及實驗室常規的病原檢測提供有力的技術支持，逐漸走向基層、走向家庭，最終讓核酸檢測隨處可行。
