稻黃單胞菌未知harpin基因的發掘與其激發HR機制的研究

《稻黃單胞菌未知harpin基因的發掘與其激發HR機制的研究》是依託上海交通大學，由陳功友擔任項目負責人的面上項目。

基本介紹

• 中文名：稻黃單胞菌未知harpin基因的發掘與其激發HR機制的研究
• 項目類別：面上項目
• 項目負責人：陳功友
• 依託單位：上海交通大學

項目摘要

稻黃單胞菌是模式植物水稻上的模式病原菌，引起的白葉枯病和細菌性條斑病是我國水稻上的重要致災病害。稻黃單胞菌在非寄主植物上產生過敏反應（HR）是由harpin蛋白決定的。除hpa1外，稻黃單胞菌還存在其它harpin編碼基因，但未能鑑別。本項目擬在hpa1和hpaB雙突變體的基礎上構建Tn5插入突變體庫，篩選鑑別未知harpin基因；擬通過hrpG和hrpX 突變體的基因晶片分析，結合已知harpin蛋白的生物學信息，鑑別受hrpG和hrpX調控的未知harpin基因，並在hpa1和hpaB雙突變體中敲除未知harpin基因，鑑別HR激發能力；對未知harpin基因進行表達，鑑別產物的HR激發能力。因HR是植物抗病免疫激活的重要表型，鑑別稻黃單胞菌未知harpin蛋白基因，對揭示植物-病原菌互作的免疫學機制具有重要的科學意義，相應的基因資源在作物抗病育種中具有重要的實踐意義和智慧財產權能

結題摘要

在植物病原細菌Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000菌株中已經證明有4個harpin蛋白。harpin類蛋白富含Gly，缺乏Cys。根據這一特點，本項目篩選Xoc BLS256基因組資料庫，得到了三個候選基因，hlpA，hlpB和hlpC。3個候選基因的基因產物的Gly含量分別達到22.6%、20.2%和19.4%，並且集中在C端。通過Smart網站對候選蛋白結構預測分析，它們均含有α螺旋結構，其與Hpa1蛋白α螺旋區域的同源性分別達到60.1%、56.4%和50.2% 。根據本實驗室的基因晶片數據，我們發現這3個候選基因都不同程度地受HrpG和HrpX調控，表達模式與Hpa1蛋白受HrpG和HrpX調控一致。這一結果支持了3個候選基因可能編碼未知harpin蛋白的可能性。為此，我們利用PVX載體系統，藉助農桿菌，以Bax和hpa1為陽性對照，發現HlpB能在激發菸草HR，說明HlpB是Xoc中另一HR激發子。非常有趣的是，HlpB是一種單鏈DNA結合蛋白，在原核生物中廣泛存在，但在植物病原黃單胞菌中高度保守。為此，我們選擇Xoc、Xcv、Ralstonia solanacearum和Pseudomonas syring中的HlpB基因進行過表達和純化，僅發現黃單胞菌來源的HlpB具有HR激發能力。在HR激發機理上， Ssbx與Hpa1一樣，缺乏Cys、熱穩定和對蛋白酶敏感，所激發的HR是一種細胞編程死亡（PCD）。HR過程需要：水楊酸SA的積累，活性氧迸發（ROS），HR 標誌基因 (HIN1, HSR203J)、病程相關蛋白基因(PR1)、PTI途徑的BAK1和BIK1以及MAP3K基因激活，乙烯和茉莉酸途徑的基因活化，最終防衛反應產生胼胝質，植物產生誘導抗病性和生長加快。Ssbx 和Hpa1激發的HR均能夠被生和生物代謝抑制劑actinomycin D, cycloheximide, 和 lanthanum chloride抑制。不僅如此，Ssbx的表達還受HrpG和HrpX調控，通過T3SS途徑進行分泌，但不依賴HpaB的控制。項目執行期間，發表相關SCI論文10篇，獲得國家發明專利1項。超額完成了預定目標。