《禽源空腸彎曲菌對人致病的毒力基因貯庫研究》是依託揚州大學，由黃金林擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：禽源空腸彎曲菌對人致病的毒力基因貯庫研究
- 項目類別：面上項目
- 項目負責人：黃金林
- 依託單位：揚州大學
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
空腸彎曲菌是全球範圍內主要的動物源性人獸共患、細菌性腸道病原菌之一，特定血清型空腸彎曲菌感染後引起的自身免疫反應可導致格林－巴利綜合徵（GBS），表現為四肢軟癱、呼吸肌麻痹、腱反射減低等症狀，醫療負擔重。家禽是人空腸彎曲菌病最重要的傳染源，感染動物通常無明顯病症，但可長期排菌。現有研究對動物源空腸彎曲菌如何作用於人，以及如何逃避宿主免疫反應並最終致病的機制還遠不明了。由於缺乏良好的動物模型，對空腸彎曲菌致病性的直接研究存在很大困難。本研究套用體內誘導抗原技術（IVIAT），分別用空腸彎曲菌感染的禽血清、人腹瀉患者血清和GBS患者血清從標準株NCTC11168表達文庫中篩選出反應的表達基因，對獲得的序列進行比較和功能分析，建立禽源空腸彎曲菌對人致病的毒力基因貯庫，初步揭示禽源空腸彎曲菌對人致病的可能分子機制，同時，也可為疫苗、診斷試劑和藥物開發奠定基礎。
結題摘要
空腸彎曲菌是全球性分布的重要的食源性病原菌。由於沒有合適的動物模型可用來研究空腸彎曲菌感染人的相關機制，而體內誘導表達抗原技術是一項新型的病原菌毒力基因篩選策略，因其不需要動物模型而備受關注。本研究將IVIAT用於空腸彎曲菌的研究在國內外尚屬空白。首先獲得了基因組表達文庫，庫容量達52 700個克隆，其可以覆蓋空腸彎曲菌NCTC 11168株的全基因組4次以上，片段插入正確率為83.3%～91.7%，片段大小介於400～3 000 bp，且均勻分布，IPTG誘導體外表達文庫後蛋白呈現正確表達。用體外條件培養的空腸彎曲菌菌體或體外誘導表達抗原，分別對病人康復期的血清和人工感染雞的高免血清作反覆吸附處理，徹底除去血清中能識別體外表達抗原的抗體，僅保留可以識別體內誘導表達抗原的抗體組份。然後，用吸附後的人和雞血清分別對體外誘導的基因組表達文庫的抗原進行免疫識別。經過初篩和2次復篩共得到了86個陽性克隆，將其送生物公司作雙向DNA測序分析，去掉其中移碼錶達和重複出現的克隆，最後確定了48個體內表達抗原的編碼基因，其中雞源有27個，人源21個。這些蛋白主要涉及細菌代謝（31.3%）、大分子生物合成（12.5%）、遺傳信息加工（18.8%）、轉導（8.3%）、調控（12.5%）及其他生物過程（8.3%），另外還有3個功能未知的蛋白（Cj0092、Cj0788、CJE1639）。用人和雞的吸附血清還篩選到了6個共有蛋白（fabH、hemL、leuC、aspS、Cj1200、Cj8486_0361），它們可能是該菌感染人和雞時在體內表達的共同抗原。另外我們還篩選到已經被證實的幾種體內表達的毒力相關基因，如chuA，flgS，cheA，flhF，rplA，Cj0190c，Cj0100和Cj0788。採用SYBR®Green實時定量PCR法定量分析（2-ΔΔCT）比較目的基因在體內外轉錄水平的差異，根據IVIAT篩選得到的48個編碼序列，按其類別隨機選取10個基因，結果顯示，Cj0100、Cj0788、Cj0284c、Cj0663和Cj1200等5個基因上調錶達。初步證實IVIAT篩選所得基因為細菌體內感染過程中表達的基因，與致病作用相關。本研究首次用IVIAT方法研究了空腸彎曲菌感染人和雞不同宿主的抗原表達譜，為解析該菌的致病機制奠定了重要基礎。
