福氏志賀氏菌多糖結合疫苗的體內生物合成研究

《福氏志賀氏菌多糖結合疫苗的體內生物合成研究》是依託中國人民解放軍軍事科學院軍事醫學研究院，由王恆梁擔任項目負責人的面上項目。

基本介紹

• 中文名：福氏志賀氏菌多糖結合疫苗的體內生物合成研究
• 項目類別：面上項目
• 項目負責人：王恆梁
• 依託單位：中國人民解放軍軍事科學院軍事醫學研究院

中文摘要

多糖結合疫苗由於能同時誘發機體非T細胞依賴和T細胞依賴的免疫反應，產生長久的免疫保護作用，作為新一代疫苗近年來越來越受到重視並在多種病原菌預防疫苗研製中得到套用。但是，目前經典的結合疫苗生產方式是通過化學交聯的方式在體外將多糖抗原與載體蛋白結合在一起。這是一種步驟繁多、耗能較大而得率較低的生產模式。近年來多種細菌蛋白糖基轉移酶的發現，為結合疫苗的體內生物合成帶來了極大的希望。另外，由於目前仍無理想的痢疾疫苗。因此，本研究擬首先通過構建無毒的志賀氏菌突變株並阻斷其脂多糖的合成，再分別將空腸彎曲桿菌的N-糖基化系統和腦膜炎奈瑟球菌的O-糖基化系統轉入該菌株，在菌體內通過上述外源導入的糖基轉移酶將Ｏ－抗原多糖轉移至不同的載體蛋白上，從而生成一類全新的糖蛋白，並進一步評價其免疫原性和保護效果，為新一代綠色環保多糖結合疫苗的研製打下基礎。

結題摘要

多糖結合疫苗是將多糖共價連線到載體蛋白，使多糖抗原（T細胞非依賴抗原）轉換為了T細胞依賴抗原，從而能夠激發體液免疫。目前市場上的多糖結合疫苗主要是利用化學法生產，需要多次純化，收率較低，生產成本大大提高，很難在開發中國家及貧窮國家普及。隨著合成生物學的發展以及細菌蛋白糖基化的發現，使得利用生物法生產多糖結合疫苗成為了可能。本研究利用來自腦膜炎奈瑟球菌的O-糖基化系統中的糖基轉移酶PglL（幾乎可以催化所有的糖），首先通過直接將外源的O-糖基轉移酶PglL及其天然底物蛋白PilE的表達載體轉入O-抗原連線酶缺失的志賀氏菌301DWP中，成功實現PilE糖基化。之後，將載體蛋白替換為市場上常用的rEPA、TTc及CTB，通過蛋白免疫印跡（WB）檢測，同樣能夠獲得較高的糖基化水平；同時發現底物蛋白融合兩個糖基化位點時，WB結果中可以檢測到兩個集中的糖基化條帶。通過純化得到高純度糖蛋白並免疫小鼠，可激發以IgG1占主導的體液免疫，並且CTB為底物蛋白時免疫效果最好。體外殺菌實驗表明抗體具有較高殺菌活性，攻毒實驗表明CTB作為底物蛋白時具有很好的保護效果。在上述基礎上我們進一步對糖基轉移酶PglL的O-糖基化位點進行了研究。將由29個胺基酸組成的糖基化位點序列縮短並最佳化，最終我們得到了PglL催化的O-糖基化修飾位點的共有序列為WPXnSXmP，其中Xn和Xm為可變的柔性胺基酸，而最優的序列為WPAAASAP，並命名為MOOR。為下一代多糖結合疫苗的精確設計打下了基礎。 目前尚未有利用O-糖基化生產多糖結合疫苗的報導，我們的研究首次利用O-糖基化生產多糖結合疫苗，並取得了成功，並對糖基化位點在原有的29個胺基酸序列的基礎上，得到了只包含8個甚至更少的胺基酸的識別序列，填補了相關理論空白並對疫苗進一步最佳化奠定了基礎。與化學法相比較，生物法生產的多糖結合疫苗更加精細、可控，產品具有很好的均一性。我們使用O-糖基化製備多糖結合疫苗的方法擴展了糖工程在多糖結合疫苗研究中的套用，為生產多糖結合疫苗開闢了新的途徑。