《硫酸酯酶對紅藻瓊膠可控酶法脫硫的分子機制研究》是依託中國海洋大學，由付曉婷擔任項目負責人的青年科學基金項目。
基本介紹
- 中文名：硫酸酯酶對紅藻瓊膠可控酶法脫硫的分子機制研究
- 項目類別：青年科學基金項目
- 項目負責人：付曉婷
- 依託單位：中國海洋大學
中文摘要,結題摘要,
中文摘要
不同凝膠強度及電內滲值的瓊膠在食品、醫藥、化工等套用領域及生化分離、分子生物學等研究領域有著重要的用途。目前常用鹼預處理及化學分離方法去除瓊膠中的硫瓊膠，以提高瓊膠的凝膠強度並降低其電內滲。本研究探索採用酶法特異性地可控脫除硫瓊膠分子中的硫酸根，以製備不同凝膠強度及電內滲值的瓊膠。本研究將以兩株自行篩選出的微生物Vibrio sp. QD-9和Agarivorans albus YKW-34為出發點，對其所產瓊膠硫酸酯酶進行分離純化、基因克隆及重組表達，對瓊膠硫酸酯酶的酶學性質及針對不同底物的酶促動力學性質進行研究，利用基因的生物信息學分析技術，闡釋其對瓊膠分子中硫酸根酶解的分子機制。該研究為瓊膠中硫酸根的可控脫除提供一種全新的思路，創新性地建立瓊膠的酶法脫硫理論，在不同凝膠強度及電內滲值的瓊膠製備方面具有重要的套用價值。
結題摘要
不同品質瓊膠在食品、醫藥、化工等套用領域及生化分離、分子生物學等研究領域有著重要的用途。目前常用鹼預處理及化學分離方法去除瓊膠中的硫瓊膠，以提高瓊膠的凝膠強度。本研究採用酶法特異性地可控脫除硫瓊膠分子中的硫酸根，以製備不同凝膠強度的瓊膠。從青島海域紅藻中篩選出一株能高效分泌芳基硫酸酯酶的菌株，經生理化特徵及16s rRNA鑑定為海單胞菌屬，命名為Marinomonas sp. FW-1。採用了單因素-回響面方法對菌株產芳基硫酸酯酶的培養條件及培養成分進行最佳化。結果表明，其最佳培養基組分為（w/v）：0.2%瓊膠，0.2%酵母膏，0.5%蛋白腖，2.89%NaCl，0.412%MgCl2·6H2O，0.1% KCl，0.02% CaCl2，0.013% K2HPO4·3H2O，0.002% FeCl2·4H2O，0.09% MnCl2，0.043%焦磷酸鈉，1.87%吐溫-80。最佳培養條件為pH7.0，培養溫度為35℃，接種量1%，發酵時間為72h。通過陰離子交換和凝膠色譜進行了FW-1產芳基硫酸酯酶的分離純化，其回收率為13%，純化倍數為12。SDS-PAGE結果表明此酶由單一肽鏈組成，分子量為33kDa。此酶的最適pH9.0，在pH 8-11穩定；最適溫度為45℃，低於55℃穩定。此酶對石花菜和江蘺瓊膠的硫酸根脫除率分別為86.11和89.61%，酶處理後的瓊膠與市售瓊膠品質相當。瓊膠是由不含有硫酸根的瓊脂糖和含有硫酸根的硫瓊膠組成，本研究通過EDTA-2Na方法從江蘺和石花菜提取硫瓊膠，分析其酶作用前後結構的變化推斷其脫硫機制。經HPLC和GC分析，硫瓊膠由α-3,6-AG和D-半乳糖交錯構成。江蘺硫瓊膠含有66.1%半乳糖和33.9%3.6-AG，分子量為4.8×105g/mol；石花菜硫瓊膠含有58.2%半乳糖、29.8% 3,6-AG、8.5% 2-甲基-3,6-AG及3.5%木糖，分子量為7.3×104g/mol。經GC-MS及NMR分析江蘺和石花菜硫瓊膠均含有4-硫酸-D-半乳糖、6-硫酸-D-半乳糖及6-硫酸-L-半乳糖，此外石花菜硫瓊膠還存在2-甲基-3,6-AG及丙酮酸基團取代。酶作用前後多糖結構差異結果表明芳基硫酸酯酶可以有效脫除D-半乳糖的C-4及C-6上和L-半乳糖的C-6的硫酸基。芳基硫酸酯酶脫除機理可為製備不同品質的瓊膠提供理論基礎。
