《短小芽孢桿菌脫毛鹼性蛋白酶基因的轉錄調控機理》是依託四川大學，由馮紅擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：短小芽孢桿菌脫毛鹼性蛋白酶基因的轉錄調控機理
- 項目類別：面上項目
- 項目負責人：馮紅
- 依託單位：四川大學
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)作為一種重要的工業微生物，產生的胞外鹼性蛋白酶具有獨特的抗氧化、抗去垢劑以及較高的熱穩定性，在洗滌、皮革脫毛等領域表現出極大的套用前景。雖然在酶的純化、催化特性和基因克隆表達等方面進行了較多的研究，但該蛋白酶基因的轉錄調控仍不清楚。我們在對短小芽孢桿菌和枯草桿菌基因組的比對分析基礎上，預測出多個轉錄因子，均可能參與該蛋白酶基因的轉錄調控。本項目擬通過這些調控基因的重組表達，運用生化技術鑑定特異結合該基因啟動子的反式調控蛋白，以及與調控蛋白互作的啟動子順式元件和核苷酸序列；進而構建啟動子突變體，與報告基因融合，轉化短小芽孢桿菌，在細胞水平上研究啟動子順式元件的生物學功能；同時構建調控基因的敲除突變體，用以研究這些調控基因在蛋白酶基因轉錄中的作用；最終闡明鹼性蛋白酶基因的轉錄調控機理，為加深了解鹼性蛋白酶以及遺傳操縱短小芽孢桿菌提供理論基礎。
結題摘要
鹼性蛋白酶是一種重要的工業用酶，廣泛套用於洗滌、製革等行業。我們從短小芽胞桿菌 (Bacillus pumilus) BA06菌株中克隆、分離純化出一個鹼性蛋白酶，具有皮革脫毛的功能，命名為脫毛鹼性蛋白酶 (DHAP)。本項目首先利用定量PCR等技術，分析了氮、碳源以及鹽脅迫對鹼性蛋白酶基因表達調控的作用，證實DHAP是BA06菌株的一個主要胞外蛋白酶；鹽脅迫在轉錄水平阻遏DHAP的表達；而且DHAP的轉錄受到碳氮源的高度調控。第二，對產生DHAP的短小芽胞桿菌 (B. pumilus) BA06菌株的基因組進行了測序，通過基因組比對分析，發現了可能參與鹼性蛋白酶基因表達調控的轉錄因子；第三，克隆、重組表達和純化了Hpr、SinR和雙組分調控蛋白DegU/DegS等調控蛋白，並採用凝膠延遲分析，證實DegU能夠直接結合DHAP基因啟動子；而DHAP啟動子序列中，存在6個Hpr蛋白結合位點；SinR不能結合DHAP啟動子。這些結果說明DegU、Hpr等蛋白可能直接參與DHAP基因的轉錄調控。第四，採用RNA-seq，分析了BA06菌株在整個生長發育過程中全基因組轉錄動態，揭示了BA06菌株細胞群體在指數生長階段、停滯期、芽胞發育及細胞衰退期不同類群基因的轉錄。最後，通過結構模擬和胺基酸序列多重排列選擇一些特定位點進行定點突變，篩選出低溫活性和熱穩定性顯著提高的DHAP突變蛋白酶，為DHAP在皮革脫毛等行業中的套用奠定了基礎。
