《病毒感染中p100蛋白與I-dsRNA相互作用的分子機制研究》是依託天津醫科大學，由何津岩擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：病毒感染中p100蛋白與I-dsRNA相互作用的分子機制研究
- 項目類別：面上項目
- 項目負責人：何津岩
- 依託單位：天津醫科大學
中文摘要,結題摘要,
中文摘要
病毒感染細胞後常導致胞漿I-dsRNA生成進而下調干擾素反應，p100蛋白可與I-dsRNA相互作用而調控細胞抗病毒過程，但具體機制不清。研究發現，病毒感染後胞漿產生的顆粒結構-應激顆粒（SGs）與I-dsRNA、p100均密切相關：p100參與SGs形成；I-dsRNA可與SGs多個組分相互作用。由此我們提出I-dsRNA-p100-SGs模型，即病毒感染時p100與I-dsRNA結合併招募應激相關蛋白，促進SGs形成；SGs則可能通過提高輔助因子濃度或複合物穩定性來促進p100對I-dsRNA的剪下從而調控干擾素反應。本課題以呼腸孤病毒感染HeLa細胞為研究模型，利用RNA干擾、螢光原位雜交、免疫共沉澱等方法探討SGs形成在p100與I-dsRNA相互作用中的意義及其對抗病毒反應的調控，有助於豐富細胞對抗病毒的分子生物學理論，為臨床抗病毒感染治療提供新思路。
結題摘要
病毒感染後胞漿產生應激顆粒，與I-dsRNA，p100均密切相關。本項目以病毒處理Hela 細胞為模型，從p100蛋白表達，SGs形成，蛋白質磷酸化等方面著手，探討p100蛋白在病毒感染引起的應激顆粒中的可能調控作用。首先我們通過免疫螢光實驗來確定p100蛋白是否存在於病毒引起的應激顆粒中。由於本實驗室獲得的MRV病毒毒株毒力太弱，因此換用了柯薩奇B3病毒感染Hela細胞，並以此作為研究模型。柯薩奇B3病毒感染Hela細胞後，引起了應激顆粒的形成，同時p100與TIA-1存在共定位現象，說明p100蛋白存在於病毒感染形成的應激顆粒中。在此基礎上我們進行了機制研究，為了確定p100蛋白是否在病毒應激過程中受到影響或是發揮作用，我們採用轉染Poly IC模擬病毒感染的過程。我們發現當以Poly IC模擬病毒感染可以引起HeLa細胞在應激條件下發生多聚糖體的解聚表明此時細胞的蛋白翻譯過程被中止。利用磷酸化抗體，採用LI-COR Odyssey®近紅外雙色雷射成像系統，我們發現應激條件下對p100蛋白的蛋白表達水平無變化，但其自身Tyr、Thr以及Ser磷酸化水平增加，同時翻譯起始因子eIF2蛋白的ser51發生磷酸化。最後我們用in-cell Odyssey法分析了p100-T103位點在HeLa細胞內的磷酸化變化。實驗發現p100-T103磷酸化並不是隨著應激時間的延長呈直線式上升，而表現為一定的波動式；表明在應激狀態下p100-T103位點可能存在一個動態的磷酸化/去磷酸化動態變化過程。為進一步探討JNK和p100蛋白在應激中的相互作用，我們給予細胞JNK抑制劑，觀察其對於應激顆粒形成的影響，結果顯示在應激條件下，在JNK抑制劑處理後， T103的磷酸化水平明顯降低，也從另一個方面證明了激活的JNK對於T103的磷酸化作用。同時免疫螢光結果顯示當給予JNK抑制劑以後應激顆粒的形成也受到一定影響。有意思的是實驗發現在應激與非應激條件下，核內的磷酸化T103都是明顯多於核外的，而且並沒有受到抑制劑的影響。於是我們分離了胞漿、胞核裂解液，發現在HeLa細胞的細胞核中並沒有JNK存在，這就暗示我們在核內可能還存在著其他能夠直接磷酸化T103的激酶。而且在該刺激條件下，還發現p100蛋白有出核的現象，至於出核的p100蛋白是參與什麼細胞生物學功能還有待進一步研究。
