基本介紹
病毒學的發展,內容和重要性,主要環節,
病毒學的發展
隨著生物學研究技術的不斷革新，病毒學的發展大致經歷了如下三個階段。
機體水平研究階段
在40年代以前，病毒學工作者主要採用敏感動物（如小白鼠）或動物胚胎（如雞胚）來分離、鑑定病毒，研究病毒的繁殖、發病機理、兔疫反應等，甚至使用受染動物組織製備疫苗，如狂犬病疫苗等。
細胞水平研究階段
在40～60年代，由於組織培養技術廣泛套用於病毒學領域，相繼分離了上百種過去對動物不敏感的新病毒，如腺病毒、副流感病毒、鼻病毒、呼吸道合胞病毒、ECHO病毒等，大大擴展了病毒學研究的範圍。組織培養技術不僅為臨床病毒學的發展奠定了基礎，而且還用於病毒複製和遺傳方面的研究，對病毒本質有了進一步的認識。此外，一批經濟、安全、有效的組織培養疫苗誕生了，如脊髓灰質炎、麻疹、風疹、腮腺炎疫苗等，為預防病毒性疾病做出了貢獻。
分子水平研究階段
另一方面，分子病毒學的研究成果，對分子生物學的發展也起了很大的推動作用。RNA腫瘤病毒反轉錄酶的發現，不僅充實了闡明DNA複製、轉錄和mRNA的翻譯表達及蛋白產物的結構功能三者關係的中心法則，而且在實際套用上，使RNA在試管內反轉錄成cDNA成為可能。病毒基因結構和表達的研究，還闡明了有關真核基因表達調控的某些原理，如基因重疊、間隙、內含子的發現，轉錄後剪修，重複序列和增強子的存在等，都大大豐富了分子生物學的內容。病毒載體的出現，又為研究真核細胞基因表達提供了一個重要的手段。
內容和重要性
根據DNA重組技術的發展及分子病毒學研究的現狀和發展趨勢，病毒基因工程包括如下主要內容。
病毒基因組的克隆、結構測定和表達
要研究病毒基因組的結構與功能的關係，一般須先建立病毒基因組的無性繁殖系，這樣才能獲得足夠量的病毒DNA。後者可採用細菌質粒、粘性質粒或λ噬菌體作為載體，轉化大腸桿菌來完成。大的DNA病毒基因組可用限制性內切酶切割成幾個片段進行克隆；RNA病毒可先在試管內反轉錄成cDNA再進行克隆；反轉錄病毒基因組可克隆其前病毒DNA。建立了病毒基因組的無性繁殖系後，就可以採用化學法（Maxam et al 1977）或酶促法（Sanger et al 1977；Messing et al 1981）測定病毒基因組的核苷酸序列，以了解基因的一級結構；結合在試管內進行的轉錄和轉譯試驗，或基因缺失變異株的互補試驗等，就可逐步闡明其結構和功能之間的關係，並了解基因表達調控的某些原理。在此基礎上，就可以設計組建病毒載體或表達病毒多肽。。
病毒基因工程疫苗的研製
對產生中和抗體的病毒多肽基因高效表達的研究，導致了新一代病毒疫苗的誕生。鑒於動物病毒的自然宿主是動物細胞，所以動物病毒基因表達的模式與其他真核基因是類似的。眾所周知，真核基因與原核基因的表達調節，在許多方面是不相同的（表1－2），其中最主要的是真核基因的不連續性，以及其調控信號不能為原核細胞正確識別。所以病毒基因在一般情況下，最好採用真核細胞系統來表達。也就是說，病毒基因工程疫苗要採用真核細胞系統來完成。可是，如果病毒基因先在試管內從mRNA反轉錄成cDNA，利用原核細胞的啟動子，也可以在原核細胞中進行表達。
抗病毒多肽物質的研製
如表1－4所示，自1979年底以來，不少人和動物的干擾素基因已經克隆成功。人
干擾素基因在原核細胞中已可高效表達，每升大腸桿菌菌液可以生產lmg干擾素，相當於2～3×108國際單位干擾素。採用DNA重組技術生產的干擾素具有與自然干擾素相同的生物學活性。採用基因工程技術還可以把幾個不同型別的干擾素基因拼接起來，生產具有不同性格的自然界所沒有的活性多肽物質，例如把αD－αA基因拼接後產生的干擾素，既具有具αD的某些性狀，又具有αA的一些性狀。所以DNA重組技術為生產人造抗病毒多肽物質開闢了一條新途徑。
動物病毒載體的組建
原核細胞系統的DNA重組技術，對真核基因，包括動物病毒基因的克隆、鑑定，無疑是十分必要的，因為真核基因工程的起始步驟，多先在原核細胞內完成。但是，正如表1－2所示，真核基因與原核基因的結構與表達調節有很大的差別，要進行病毒基因或其他直接基因的表達調節研究，就必須建立一種真核基因工程系統。考慮到λ噬菌體載體（一種細菌的病毒）在大腸桿菌克隆系統中表現出很多優點，許多學者也就對採用動物病毒作為真核細胞克隆和表達的載體，寄予很大的希望。動物病毒載體的組建有兩種類型：第一是組建含有目的基因的感染性重組病毒，隨著病毒的繁殖，使目的基因有效表達。採用這一系統時，除反轉錄病毒外，大多數感染性病毒可以殺死細胞。第二是建立一種能使病毒載體複製的游離基因，其優點是，可以用來建立不產生感染性病毒顆粒就可以不斷表達外源性基因的細胞系，而且還可以克服病毒顆粒包裝容量的限制。根據不同目的和要求，這兩類動物病毒載體各有其用處。
主要環節
供體DNA或外源性DNA
它可以通過提取、人工合成或從mRNA反轉錄獲得。由於大多數真核基因和病毒基因有插入順序，所以從mRNA反轉錄合成的cDNA往往不能完全代表真核基因的真正結構。
載體
載體也就是轉移外源性DNA片段的運載體，常用的有細菌質粒、粘性質粒、酵母質粒、噬菌體或動物病毒。根據不同的目的和要求選用不同的載體系統，也可不用載體把外源性DNA直接轉移到受體細胞中去。
受體細胞
受體細胞就是指作為DNA重組體增殖或複製的宿主細胞。如果採用細菌時，要考慮到安全性。現認為，大腸桿菌K12品系是安全的。如採用動物細胞來生產疫苗或其他活性多肽時，要考慮到潛在的致癌因子。
重組體的改造與基因表達
人工合成一個DNA片段，含有一定的酶切點以及所需要的序列。．加上人工合成的接頭，造成一定的內切酶粘性末端；用末端轉移酶在3′端加上dA－dT，或 dC－dG後進行接連；．使粘端修飾成平端，或用Bal 3l修飾後，再進行平端連線；．T4DNA 連線酶進行平端連線；．T4DNA 連線酶進行粘端連線；．人類遺傳病的基因治療。．利用病毒基因組中的基因表達增強子；．高效表達真核基因，用於研製病毒疫苗或生產多種活性多肽物質；．研究真核基因表達調控原理；．在動物病毒載體中，要考慮基因表達增強子的作用。而在λ噬菌體，目前尚未見報導。．在病毒載體中，還沒有有效的可以控制病毒基因轉錄的具體方法。而在λ噬菌體的克隆實驗中，可以採用λcIts857的溶原性細菌或帶有cIts857的質粒來控制PL啟動子。採用這樣的系統，就可以表達許多對細菌本身有毒性的多肽。動物病毒作為載體，首先要求對該病毒的轉錄機制有清楚的了解。因為在大多數情況下，真核基因克隆的目的是要使插入基因能夠高效表達；而在λ或M13噬菌體的大多數工作中，基因克隆的目的大都是為了使外源性DNA進行擴增或者進行序列分析。．作為載體的多數病毒基因的非必需區比較短。在設計λ噬菌體載體時，最簡單的途徑就是先確定一個對溶細胞性生長不必要的基因片段，然後在這一非必需區替代外源性DNA；在設計動物病毒載體時，外源性DNA往往代替了病毒基因的必需區。因此，重組病毒是絕對缺損性的，必須在輔助病毒存在的條件下才能繁殖，或者在染色體中已整合有輔助病毒基因的細胞中才能生長。再者，能夠作為感染性病毒繁殖的重組DNA分子大小，還要受到病毒顆粒包裝容量的限制，還沒有動物病毒的試管內包裝系統。可以製備單一成分病毒疫苗，也可以製備同一病毒的多個成分的病毒疫苗。可以完全去除病毒基因中具有潛在危害性的部分，例如某些病毒的致癌基因；如採用重組病毒系統，例如痘苗病毒，易於製備同一載體的多價病毒疫苗；可以生產尚無敏感細胞的病毒疫苗，例如B型肝炎病毒表面抗原疫苗；生產成本可以大幅度降低；年代以來，分子生物學有了飛躍的發展，新技術、新方法的套用，使病毒學的研究煥然一新。在這一時期內基本上弄清了DNA和RNA病毒的繁殖機理，發現了一類亞病毒，建立了許多病毒基因組的無性繁殖系；闡明了某些病毒的結構與功能的關係和一些病毒的基因表達調控原理；搞清了有48，502對核苷酸的λ噬菌體DNA的全結構（Sanger et al 1982）以及許多動物病毒基因組的一級結構，甚至具有十幾萬對核苷酸的EB病毒基因組的序列分析也已完成（Epstein，個人通訊1984）。分子病毒學在理論上的迅速發展，給病毒性疾病的防治實踐帶來了新的突破。如果說，由受染動物組織製備的病毒疫苗為第一代產品；由受染組織培養細胞製備的為第二代；那么，採用DNA重組技術生產的病毒疫苗則為第三代。口蹄疫病毒基因工程疫苗在進行動物實驗，B型肝炎病毒疫苗也已經研製成功。DNA重組技術不僅更新了病毒疫苗，對預防病毒性疾病將做出重大的貢獻；而且也使抗病毒治療發生了革命性的變化。例如，具有廣譜抗病毒活性的多肽物質——干擾素，在我國也已經可以採用基因工程技術，由細菌發酵來生產（侯雲德等1982，1983，1984）。DNA重組技術為生產新的多肽類藥物，開闢了一條新的途徑。1892年ИBAHOCКИЙ發現病毒以來，病毒學在人類與病毒性疾病長期鬥爭的實踐中，已逐步發展成為在生物學界和醫學界中一門十分重要的學科。鑒於象B型肝炎、流行性出血熱、病毒性腦炎、病毒性肺炎、流行性感冒等一些病毒性疾病在我國還比較嚴重，所以病毒學在我國衛生保健事業中占有十分重要的地位。
