基本介紹
- 中文名：異質系克隆
- 外文名：heteroclone
- 關鍵字：放線菌，基因重組
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馬—牛異種克隆胚胎及其線粒體異質性的研究
沈彥軍
【摘要】： 本研究以新疆伊犁馬的體細胞為供體,牛卵母細胞為受體,構建馬—牛異種克隆胚胎,探討了馬—牛異種克隆體外培養發育的影響因素,建立了馬—牛異種克隆胚胎的體外培養體系,此外,本研究還利用Taqman定量PCR法,對馬—牛異種克隆胚胎附植前各時期胚胎中的線粒體組成進行定量分析。結果表明,牛的卵母細胞能支持馬體細胞進行重編程,馬—牛異種克隆胚胎線粒體存在異質性。本研究對探討利用異種克隆技術繁育優良馬匹和探索異種克隆機制奠定了一定的基礎,提供了參考依據。 1.馬體細胞系的建立: 利用貼壁培養法建立了耳成纖維細胞系、胎兒成纖維細胞系和顆粒細胞系,並分別對這三種細胞系進行了細胞生物學特徵觀察和染色體核型及倍性統計分析。所建立的三種細胞系形態均一、染色體倍性穩定,完全滿足體細胞核移植對供體細胞的要求。 2.馬—牛無透明帶卵異種克隆胚胎的構建及體外培養體系的建立: ①本研究創建了顯微擠壓去核與無透明帶手工融合相結合方法構建馬—牛異種克隆胚胎。分析了不同激活方法、不同體外培養液、體細胞不同處理方式以及顯微注射核移植方法對馬—牛異種重構胚融合率和胚胎髮育的影響。結果表明,利用接觸抑制調節的耳成纖維細胞為供體,採用無透明帶手工融合法構建馬—牛異種重構胚具有較高的融合率(90.33%),並且經A23187處理5min+6-DMAP處理6h激活後,用mCR1aa體外培養液培養,卵裂率較高(83.65%),且卵裂球大小均一、碎片少、胚胎質量較高,並發育到囊胚(2.72%)。 ②通過對馬—牛異種克隆與牛的同種克隆的發育能力進行比較,發現牛的卵母細胞能夠支持馬的供體細胞去分化,進行核重編程。但是由於二者的物種距離較遠,異種克隆胚胎的發育能力遠低於同種克隆胚胎,囊胚率為(2.71% vs 37.48%)。 3.馬—牛異種克隆胚胎附植前各時期胚胎中的線粒體組成進行定量分析: ①在所檢測的七個胚胎髮育前期的馬—牛異種克隆胚胎中,線粒體存在異質性,並且馬的線粒體相對含量較少,只占牛的0.08%(異常桑葚胚期)～0.42%(囊胚期)。 ②受體牛的mtDNA拷貝數由1-細胞期到4-細胞呈逐漸增加趨勢,從8-細胞期到桑葚胚期,呈逐漸減少趨勢,而馬的mtDNA拷貝數在1-細胞期到囊胚期整體呈現增長趨勢。並且在8-細胞期,二者的線粒體拷貝數都減少。因此,推測馬—牛異種克隆胚胎在8-細胞～16細胞期發生MET,並且胚胎基因組支持供體馬的線粒體的遺傳複製。 ③在桑葚胚期供體馬的mtDNA和受體牛的mtDNA拷貝數都發生不同程度的的減少,分別減少到159和1.84×105,而且二者的比值也銳減到0.09%,顯著低於1-細胞期。推測線粒體和核基因組之間的相互作用出現紊亂,並導致異種克隆胚胎的發育停滯,其具體機制還需進一步研究。
【學位授予單位】：中國農業科學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：S821;S823;Q813
【DOI】：CNKI:CDMD:2.2009.152732
