《用於檢測人類EGFR基因突變的引物、探針及其使用方法》是廈門艾德生物醫藥科技有限公司於2009年4月13日申請的專利，該專利申請號為2009101114992，公布號為CN101608240，公布日為2009年12月23日，發明人是阮力、何東華、鄭立謀。
《用於檢測人類EGFR基因突變的引物、探針及其使用方法》涉及基因突變的檢測。該發明的方法包括（1）提供引物和探針；（2）待測樣品處理和模板提取；（3）配製螢光PCR擴增突變基因序列的反應體系；（4）用步驟（1）的引物和探針擴增待測的突變基因靶序列；（5）利用雙環探針與擴增產物的雜交，檢測反應體系的FAM和HEX或ROX螢光強度作為結果的判斷標準。該發明的引物、探針及方法：可同時檢測EGFR基因的29缺失突變；靈敏度高；特異性強；選擇性能力強；檢測速度快，整個檢測過程只需要90分鐘。
2020年7月，《用於檢測人類EGFR基因突變的引物、探針及其使用方法》獲得第二十一屆中國專利銀獎。
基本介紹
- 中文名：用於檢測人類EGFR基因突變的引物、探針及其使用方法
- 公布號：CN101608240
- 公布日：2009年12月23日
- 申請號 ：2009101114992
- 申請日 ：2009年4月13日
- 申請人 ：廈門艾德生物醫藥科技有限公司
- 地址 ：福建省廈門市海滄區新陽街道翁角路289號科創中心2號廠房5層
- 發明人 ：阮力、何東華、鄭立謀
- Int. Cl. ：C12Q1/68（2006.01）I、C12N15/11（2006.01）I、G01N21/64（2006.01）I
- 專利代理機構 ：廈門市首創君合專利事務所有限公司
- 代理人 ：張松亭
- 類別：發明專利
背景技術,發明內容,專利目的,技術方案,有益效果,附圖說明,技術領域,權利要求,實施方式,操作內容,實施案例,榮譽表彰,
背景技術
人類表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）存在於所有正常上皮和部分間葉來源的細胞，對細胞的生長、分化的調節有重要作用。EGFR可以激活酪氨酸激酶，從而打開下游信號通路。因此，EGFR成為腫瘤尤其是非小細胞肺癌靶向治療研究的一個重要靶點。2009年以前，臨床上EGFR靶向治療主要包括小分子酪氨酸激酶抑制劑和單克隆抗體兩個部分，如阿斯利康公司的吉非替尼（易瑞沙），羅氏公司的惡羅替尼（特羅凱）。
截至2009年大量研究發現一些肺癌病人EGFR基因的編碼區，主要是在外顯子18-21上會發生突變，而這些突變與吉非替尼和惡羅替尼等藥物的臨床療效有關，即與藥物反應性有關，原因可能是因為這些突變改變了EGFR胞內ATP結合區的結構，提高了EGFR對吉非替尼的結合能力。2009年以前，雖然已經發現不下30種突變，不過主要是外顯子19上的缺失突變和外顯子21上L858R的點突變；外顯子19上747-750位胺基酸的大約有20多種不同缺失約占突變的45％，其中以2235_2249del15和2236_2250del15最為常見；外顯子21上858位胺基酸的替代約占突變的40-45％；外顯子18點突變（G719S或G719C）約占突變的5％；外顯子20上的插入突變約占突變的1％左右。外顯子18的G719X突變約占突變的5％左右。但是，在肺癌患者中EGFR的突變率並不高，美國肺癌病人中EGFR基因的突變率僅有2％，日本為40％。中國女性非小細胞肺癌的病人中EGFR基因的突變率為30％，如果這部分患者均能套用吉非替尼或惡羅替尼治療將會明顯改善預後。
這些靶向藥物雖然對某些人群療效非常，但是價格昂貴，如果病人不攜帶有EGFR突變而服用此類藥物，不僅耽誤病情還造成巨額藥費的浪費。因此，在用藥前篩查檢測病人是否攜帶有EGFR基因突變顯得尤為重要，也是未來腫瘤個體化治療的發展方向。所以，如何快速準確地檢測這些與藥物反應性有關的EGFR基因突變成為人們亟待解決的問題。
建立對腫瘤病人EGFR基因突變檢測方法不同於檢測一般性的遺傳突變，一般的遺傳性突變即便是雜合性突變（異質性）和野生比例永遠是1/1，靠一般的探針技術就可以對突變和野生進行很好的區分。然而，這些EGFR突變都是體細胞突變，提取模板中存在大量野生型DNA，突變所占比例不確定，直接來自手術切除的樣品，突變比例高，可能達到20％以上，或許突變含量只有0.1％。雖然可以通過顯微雷射捕獲樣品中的腫瘤細胞，提高樣品中腫瘤細胞的比率。不過即便是腫瘤細胞，也不是100％的腫瘤細胞都帶有此類突變，處於不同腫瘤組織部位的細胞或許不太一樣。如果是來自血液的樣品突變含量或許會更低。這就是稀有突變檢測的難點：一面要具有高靈敏的檢測能力——個位數甚至單個突變拷貝，另外必須保證極高的特異性——面對上千倍上萬倍的野生型模板的干擾，不出現假陽性。
2009年以前檢測EGFR基因稀有突變的方法有多種，檢測能力在1％～20％。主要有兩大類，一類是非實時PCR，主要有測序和DHPLC，檢測能力僅為20％和5％，而且需要PCR後處理，步驟繁瑣，耗時長，容易污染；另一類是實時PCR，雖然都是基於實時PCR的技術平台，但是為了提高檢測方法的選擇能力，不同學者所用策略不盡相同。主要有完全依賴DNA序列自身識別特異性和依賴酶識別特異性兩大類策略，有TaqMan探針、高分辨熔解曲線分析、競爭性抑制實時PCR方法，檢測能力5％～20％之間，DxS蠍子引物法檢測能力可達1％。
截至2009年，研究發現在病人的外周血液中能夠檢測到癌細胞逸出的突變DNA，成為良好的腫瘤早期診斷、治療預後的生物標記。Kimura等（2006年）報導能夠在循環血血清中檢測到EGFR突變。認為檢測這些外周血液中的突變DNA，可以知道靶向藥物靶標位點的分子學特徵，從而判斷哪個藥物對病人最有效。但是，外周血液中癌細胞的突變DNA是存在於大量野生型基因背景下的極為稀少的突變基因，其存在比率一般小於0.2％，即便是手術切除的肺癌組織中也混雜了大量的正常細胞，而且並不是所有的腫瘤細胞都帶有突變。上述方法不能滿足越來越多的無創的突變檢測需要，因此能否準確無創地檢測這類稀有突變對2009年以前檢測技術提出了挑戰。
發明內容
專利目的
《用於檢測人類EGFR基因突變的引物、探針及其使用方法》的目的為了克服2009年以前技術檢測能力有限，現提供一種檢測人類表皮生長因子受體EGFR基因29種突變的螢光PCR方法。
技術方案
《用於檢測人類EGFR基因突變的引物、探針及其使用方法》的技術方案是，一種檢測人類表皮生長因子受體EGFR基因29種突變的螢光PCR方法，其包括以下步驟：
（1）根據人類表皮生長因子受體（EGFR）基因18、19、20、21外顯子的野生型基因序列和和相應突變基因序列，設計多對高特異性簡併引物和多個特異性雙環探針。
（2）配製螢光PCR擴增突變基因序列的反應體系。
（3）用步驟（1）的各種特異性簡併引物和特異性雙環探針同時擴增待測的29種缺失突變基因序列。
（4）利用雙環探針與擴增產物的雜交，檢測反應體系的FAM和HEX或ROX螢光強度，以HEX（或ROX）信號達到設定閾值（Ct＞18）時表明上樣DNA量在允許範圍內，FAM信號結果可信；以FAM達到設定的閾值時所需要的循環次數Ct值作為陰陽性判斷的標準，Ct值為0或35：陰性；Ct小於32：陽性。螢光PCR的反應體系為：
1×PCR緩衝液
MgCl2 | dNTP各 | 各對引物 | 各條探針 | Taq酶 | 模板 | 總體積 |
5.0～10.0毫摩爾 | 0.8～1.5毫摩爾 | 0.1~1.0微摩爾 | 0.5~1.0微摩爾 | 2.0～3.0U | 4.0～6.0微升 | 40～60微升 |
所述螢光PCR的反應條件是95℃預變性5分鐘，15個循環94℃變性15秒，66℃退火40秒，72℃延伸10秒，35個循環94℃變性15秒，56℃退火40秒，72℃延伸10秒，35個循環，後35個循環在退火時檢測FAM和HEX或ROX螢光信號。
所述的缺失突變為肺癌患者表皮生長因子受體（EGFR）基因29種常見突變，具體相見表1：
表1：肺癌患者表皮生長因子受體（EGFR）基因的29種突變
突變名稱 | 突變 | 外顯子 | 鹼基變化 | Cosmic ID |
|---|---|---|---|---|
Ex18-mutant-1 | G719A | 18 | 2156G>c | 6239 |
Ex18-mutant-2 | G719s | 18 | 2155G>A | 6252 |
Ex18-mutant-3 | G719c | 18 | 2155G>T | 6253 |
Ex19-mutant-1 | E746_A750del（1） | 19 | 2235_2249de115 | 6223 |
Ex19-mutant-2 | B746_A750del（2） | 19 | 2236_2250dcl15 | 6225 |
Ex19-mutant-3 | L747_P753>s | 19 | 2240_2257del18 | 12370 |
Ex19-mutant-4 | B746_T751>I | 19 | 2235_2252>AAT（complcx） | 13551 |
Ex19-mutant-5 | E746_T751del | 19 | 2236_2253del18 | 12728 |
Ex19-mautant-6 | E746_T751>A | 19 | 2237_2251del15 | 12678 |
Ex19-mutant-7 | E746_S752>A | 19 | 2237_2254de118 | 12367 |
Ex19-mutant-8 | E746_S752>V | 19 | 2237_2250>T（complex） | 12384 |
Ex19-rmutant-9 | E746_S752>D | 19 | 2238_2255del18 | 6220 |
Ex19-mutant-10 | L747_A750>P | 19 | 2238_2248>GC（complex） | 12422 |
Ex19-mutant-10 | L747_A750>P | 19 | 2238_2248>GC（complex） | 12422 |
Ex19-mutant-11 | L747_T751>Q | 19 | 2238_2252>GCA（complex） | 12419 |
Ex19-mutant-12 | L747_E749dcl | 19 | 2239_2247del9 | 6218 |
Ex19-mitant-13 | L747_T751del | 19 | 2239_2253del15 | 6254 |
Rx19-mutant-14 | 1747_S752del | 19 | 2239_2256dc118 | 6255 |
Ex19-mutant-15 | L747_A750>P | 19 | 2239_2248TTAAGAGAAG>C（complex） | 12382 |
Ex19-mutant-16 | L747_P753>Q | 19 | 2239_2258>CA（complex） | 12387 |
Ex19-mutant-17 | L747_T7S1>S | 19 | 2240_2251del12 | 6210 |
Ex19-mutant-18 | L747_T751del | 19 | 2240_2254del15 | 12369 |
Ex19-rmutant-19 | L747_T7S1>P | 19 | 2239_2251>C（complex） | 12383 |
Ex20-mutant-1 | T790M | 20 | 2369C>T | 6240 |
Ex20-mutant-2 | S768I | 20 | 2303G>T | 6241 |
Ex20-mutant-3 | H773_V774insH | 20 | 2319_2320insCAC | 12377 |
Ex20-mutant-4 | D770_N771insG | 20 | 2310_2311insGGT | 12378 |
Ex20-mutant-5 | v769_D770insASV | 20 | 2307_2308insgecagcgtg | 12376 |
Ex21-mutant-1 | L858R | 21 | 2573T>G | 6224 |
Ex21-mutant-2 | L861Q | 21 | 2582T>A | 6213 |
29種突變分8個PCR反應檢測，各管檢測的突變見表2。
管號 | 突變 |
|---|---|
1 | 19外顯子缺失 |
2 | L858R |
3 | T790M |
4 | 20M2-21M2 |
5 | 20外顯子缺失 |
6 | 18M1 |
7 | 18M2-3 |
8 | 外控 |
所述特異性引物和特異性探針相見表3。
表3特異性引物和特異性探針
引物名稱 | 序列 | 序列號 |
18-F1 | 5-GAATTCAAAAAGATCAAAGTGCTGGC-3 | SEQ IDNO：1 |
18-F2 | 5-CTGAATTCAAAAAGATCAAAGTGCTGA-3 | SEQ IDNO：2 |
18-F3 | 5-CTGAATTCAAAAAGATCAAAGTGCTGT-3 | SEQ IDNO：3 |
18-R | 5-TCTGGGcTccccAcCAGAC-3 | SEQ IDNO：4 |
18-Probe | FAM-5-CGTGCCGCGTTCGcCACGGTGTATAAGGACACCGT-3'-TAMRA | SEQ IDNO：21 |
19-F1 | 5'-GTTAAAATTCCCGTCGCTATCAAAAC-3 | SEQ IDNO：5 |
19-P2 | 5GTTAAAATTCCCGTCGCTATCAAAATATC-3 | SEQ IDNO：6 |
19-F3 | 5-TcccGTcGCTATCAAGGATC-3 | SEQ IDNO：7 |
19-F4 | 5-ccCGTcGCTATCAAGGAGC-3 | SEQ ID NO：8 |
19-F5 | 5-TCCCGTCGCTATCAAGGAAC-3' | SEQ IDNO：9 |
19-F6 | 5-TrcccaTCGCTATCAAGGAATCTT-3 | SEQ IDNO：10 |
19-R | 5-cGGcTGCCAGACATGAGAAAAG-3' | SEQ IDNO：11 |
19-Probe | FAM-5"TTCTGCTAAAGCAGAAACTCACATCGAGATGTGA-3”一TAMRA | SEQ IDNO：22 |
20-F1 | 5'-GAAGCCTACGTGATGGCCAT-3' | SEQ DNO：12 |
20-F2 | 5-GTGGACAAcCCCcAcCAc-3' | SEQ DNO：13 |
20-F3 | 5-CGTGGACAACCCCCACCA-3' | SEQ DNO：14 |
20-F4 | 5'-ATGGCCAGCGTGGACGGT-3 | SEQ DNO：15 |
20-F5 | 5-TGATGGCCAGCGTGTc-3' | SEQ DNO：16 |
20-R | 5-GAGCAGGTACTGGGAGCC-3 | SEQ DNO：17 |
20-Probe | FAM-5"AGCCGACCTTCGGCTGCCTCCTGGAAGGAGG-3'-TAMRA | SEQ DNO：23 |
21-F1 | 5^TGTCAAGATCACAGATT1TGGGGG-3 | SEQ IDNO：18 |
21-F2 | 5'CAGATTTTGGGCrGGCCAAAAA-3' | SEQ IDNO：19 |
21-R | 5-GGAAAATGCrGGCTGACCTAAAG-3' | SEQ IDNO：20 |
21-Probe | FAM-5"-AAGTAAGCCTCCTTACTTTGCCTCCTTCTGCAAGGAGGC -3'一TAMRA | SEQ IDNO：24 |
所述一種檢測人類表皮生長因子受體EGFR基因29種突變的螢光PCR方法不包括對待測樣品處理和模板提取步驟，但對於來自甲醛固定石蠟包埋的樣品和來自血漿的樣品所獲得的短片段DNA依然具有與新鮮組織樣品DNA同樣的擴增和檢測能力。
《用於檢測人類EGFR基因突變的引物、探針及其使用方法》在特異性引物和雙環探針技術的基礎上，建立了多重實時PCR同時檢測29種人類表皮生長因子受體（EGFR）基因突變，此方法：
（1）可在一個PCR管里同時檢測EGFR基因的19缺失突變；
（2）靈敏度高，5-10拷貝的突變即可檢出；
（3）特異性強，10納克野生型基因組DNA不會有非特異信號；
（4）選擇性能力強，可以在10納克野生型基因組DNA背景下檢出0.1％~1％的缺失突變DNA；
（5）檢測速度快，整個檢測過程需要90分鐘。
圖1至圖2為《用於檢測人類EGFR基因突變的引物、探針及其使用方法》單管螢光PCR檢測19種EGFR基因缺失突變的檢測曲線圖。
圖1為《用於檢測人類EGFR基因突變的引物、探針及其使用方法》單管螢光PCR檢測不含19種EGFR基因缺失突變的陰性對照樣品檢測曲線圖；
圖2為《用於檢測人類EGFR基因突變的引物、探針及其使用方法》單管螢光PCR檢測含19種EGFR基因缺失突變的其中一種或多種的樣品檢測曲線圖。
《用於檢測人類EGFR基因突變的引物、探針及其使用方法》涉及基因突變檢測，特別涉及檢測人類表皮生長因子受體EGFR基因29種缺失突變的引物、探針及方法。
1.用於檢測人類EGFR基因突變的引物及探針，包括下列4組引物和探針：
（1）、5′-GAATTCAAAAAGATCAAAGTGCTGGC-3′ SEQ ID NO：1
5′-CTGAATTCAAAAAGATCAAAGTGCTGA-3′ SEQ ID NO：2
5′-CTGAATTCAAAAAGATCAAAGTGCTGT-3′ SEQ ID NO：3
5′-TCTGGGCTCCCCACCAGAC-3′ SEQ ID NO ：4
FAM-5′-CGTGCCGCGTTCGGCACGGTGTATAAGGACACCGT-3′-TAMRA SEQ ID NO：21
（2）、5′-GTTAAAATTCCCGTCGCTATCAAAAC-3′ SEQ ID NO：5
5′-GTTAAAATTCCCGTCGCTATCAAAATATC-3′ SEQ ID NO：6
5′-TCCCGTCGCTATCAAGGATC-3′ SEQ ID NO：7
5′-CCCGTCGCTATCAAGGAGC-3′ SEQ ID NO：8
5′-TCCCGTCGCTATCAAGGAAC-3′ SEQ ID NO：9
5′-TTCCCGTCGCTATCAAGGAATCTT-3′ SEQ ID NO：10
5′-CGGCTGCCAGACATGAGAAAAG-3′ SEQ ID NO：11
FAM-5′ TTCTGCTAAAGCAGAAACTCACATCGAGATGTGA-3′-TAMRA SEQ ID NO：22
（3）、5′-GAAGCCTACGTGATGGCCAT-3′ SEQ ID NO：12
5′-GTGGACAACCCCCACCAC-3′ SEQ ID NO：13
5′-CGTGGACAACCCCCACCA-3′ SEQ ID NO：14
5′-ATGGCCAGCGTGGACGGT-3′ SEQ ID NO：15
5′-TGATGGCCAGCGTGTC-3′ SEQ ID NO：16
5′-GAGCAGGTACTGGGAGCC-3′ SEQ ID NO：17
FAM-5′ AGCCGACCTTCGGCTGCCTCCTGGAAGGAGG-3′ -TAMRA SEQ ID NO：23
（4）、5′-TGTCAAGATCACAGATTTTGGGGG-3′ SEQ ID NO：18
5′-CAGATTTTGGGCTGGCCAAAAA-3′ SEQ ID NO：19
5′-GGAAAATGCTGGCTGACCTAAAG-3′ SEQ ID NO：20
FAM-5′-AAGTAAGCCTCCTTACTTTGCCTCCTTCTGCAAGGAGGC-3′-TAMRA SEQ ID NO：24。
2.一種試劑盒，至少包括：權利要求1所述的4組引物和探針，以及PCR反應緩衝液。
《用於檢測人類EGFR基因突變的引物、探針及其使用方法》以人類EGFR基因19外顯子的19種缺失突變為檢測對象，通過特異引物的最佳化組合以及聯合使用雙環探針，從而實現快速準確、簡單地同時檢測19種缺失突變，而且檢測突變的能力高達0.1％~0.1％。
野生型細胞系H460的基因組DNA為野生型模板，以細胞系H1650為19-M1（2235_2249del15）模板，其他18種缺失突變以經過基因工程構建的突變質粒作為突變模板，建立單管螢光PCR檢測EGFR基因19種缺失突變的反應體系，並將此體系用於EGFR缺失突變的快速檢測。此方法主要包括以下步驟：
（1）根據Cosmic數據公布的人類表皮生長因子受體（EGFR）基因19外顯子的野生型基因序列和19種缺失突變基因序列，設計多對高特異性簡併引物和多個特異性雙環探針。
（2）待測樣品處理和模板提取。
（3）螢光PCR擴增。
（4）檢測螢光信號，以達到設定的閾值時所需要的循環次數Ct值作為結果判斷的標準。
步驟（1）中根據Cosmic數據公布的人類表皮生長因子受體（EGFR）基因19外顯子的野生型基因序列和19種缺失突變基因序列，設計多對高特異性簡併引物和多個特異性雙環探針，詳見表3。
步驟（2）樣品處理和模板提取，樣品適用範圍包括手術切除的新鮮病理組織，甲醛固定石蠟包埋病例組織，石蠟切片，全血，血漿，血清，胸腔積液等標本。新鮮病理組織，取綠豆大小，約1g重，使用Qiagen公司組織DNA提取試劑盒提取基因組DNA，具體步驟按試劑盒操作說明。蠟塊樣品切成5～8微米切片，取5片，或已經製成的5～8微米片取5片，經過二甲苯脫蠟後，使用Qiagen公司石蠟包埋DNA提取試劑盒提取基因組DNA，具體步驟按試劑盒操作說明。全血、血漿、血清以及胸腔積液樣品，使用Qiagen公司組織DNA提取試劑盒提取基因組DNA，具體步驟按試劑盒操作說明。每次提取全血200微升，血漿、血清以及胸腔積液不少於800微升。所提DNA溶於Tris-HCl（10毫摩爾每升，pH8.0），經紫外分光光度計檢測提取質量，並確定濃度，用Tris-HCl溶液（10毫摩爾每升，pH8.0）調整DNA濃度到2納克每微升作為PCR擴增的模板。
步驟（3）的螢光PCR擴增反應體系為：
1×PCR緩衝液
MgCl2 | dNTP各 | 各對引物 | 各條探針 | Taq酶 | 模板 | 總體積 |
1.0毫摩爾 | 1.0毫摩爾 | 0.1~1.0微摩爾 | 0.5~1.0微摩爾 | 2.5U | 5微升 | 40微升 |
以上試劑組分：1×PCR緩衝液，MgCl2，Taq酶，dNTP均購自中國大連寶生物公司。
所述螢光PCR的反應條件是95℃預變性5分鐘，15個循環94℃變性15秒，66℃退火40秒，72℃延伸10秒，35個循環94℃變性15秒，56℃退火40秒，72℃延伸10秒，35個循環，後35個循環在退火時檢測FAM和HEX或ROX螢光信號。
步驟（4）檢測FAM和HEX螢光信號的Ct值，是採用Mx3000P螢光PCR擴增儀或Mx3005P螢光PCR擴增儀或Rotor-Gene3000螢光PCR擴增儀或Rotor-Gene6000螢光PCR擴增儀或ABI7500螢光PCR擴增儀。，一次可檢測96份樣品（包括陰陽性對照）。根據螢光PCR擴增儀顯示的Ct值判斷結果：檢測反應體系的FAM和HEX螢光強度，以HEX信號達到設定閾值（Ct＞18）時表明上樣DNA量在允許範圍內，FAM信號結果可信；以FAM達到設定的閾值時所需要的循環次數Ct值作為陰陽性判斷的標準，Ct值為0或35：陰性；Ct小於32：陽性。
實施案例
- 實施例1
該實施例中以EGFR基因熱點突變外顯子19上的E746_A750del（2235_2249del15）突變為例來分析《用於檢測人類EGFR基因突變的引物、探針及其使用方法》的單管螢光PCR檢測EGFR基因19種缺失突變的方法。實驗用細胞系4株，分別為H1650（帶E746_A750del突變）、H460（EGFR基因野生型）、293T（EGFR基因野生型）、SW480（EGFR基因野生型）；100份健康的無償獻血者全血樣品、62份臨床肺癌樣品（包括新鮮組織、石蠟切片、胸腔積液、全血）。
利用上述螢光PCR檢測EGFR基因熱點突變外顯子19上的E746_A750del（2235_2249del15）突變的方法包括以下步驟：
（1）樣品處理和模板提取質控：樣品適用範圍包括手術切除的新鮮病理組織，甲醛固定石蠟包埋病例組織，石蠟切片，全血，血漿，血清，胸腔積液等標本。新鮮病理組織，取綠豆大小，約1g重，使用Qiagen公司組織DNA提取試劑盒提取基因組DNA，具體步驟按試劑盒操作說明。蠟塊樣品切成5～8微米切片，取5片，或已經製成的5～8微米切片取5片，經過二甲苯脫蠟後，使用Qiagen公司石蠟包埋DNA提取試劑盒提取基因組DNA，具體步驟按試劑盒操作說明。全血、血漿、血清以及胸腔積液樣品，使用Qiagen公司組織DNA提取試劑盒提取基因組DNA，具體步驟按試劑盒操作說明。每次提取全血200微升，血漿、血清以及胸腔積液不少於800微升。所提DNA溶於Tris-HCl（10毫摩爾每升，pH8.0），經紫外分光光度計檢測提取質量，並確定濃度，用Tris-HCl溶液（10毫摩爾每升，pH8.0）調整DNA濃度到100納克每微升或2納克每微升作為PCR擴增的模板。
（2）螢光PCR擴增，配製反應體系：
MgCl2 | dNTP各 | 各對引物 | 各條探針 | Taq酶 | 模板 | 總體積 |
7.0毫摩爾 | 1.0毫摩爾 | 0.1~1.0微摩爾 | 0.5~1.0微摩爾 | 2.5U | 5微升 | 50微升 |
所述螢光PCR的反應條件是95℃預變性5分鐘，15個循環94℃變性15秒，66℃退火40秒，72℃延伸10秒，35個循環94℃變性15秒，56℃退火40秒，72℃延伸10秒，35個循環
（3）檢測：採用Mx3000P實時PCR擴增儀（StrataGene公司）後35個循環退火階段檢測FAM和HEX或ROX螢光信號，一次可以檢測96份樣品（包括陰陽性對照）。結果判斷：根據螢光PCR擴增儀顯示的Ct值判斷結果：檢測反應體系的FAM和HEX螢光強度，以HEX信號達到設定閾值（Ct＞18）時表明上樣DNA量在允許範圍內，FAM信號結果可信；以FAM達到設定的閾值時所需要的循環次數Ct值作為陰陽性判斷的標準，Ct值為0或35：陰性；Ct小於32：陽性。
前述100份健康獻血者全血樣品以及細胞系H460（EGFR基因野生型）、293T（EGFR基因野生型）、SW480（EGFR基因野生型），突變細胞系H1650（帶E746_A750del突變）經該發明的體系檢測，只有H1650細胞系DNA有螢光信號，其他樣品無螢光信號，進一步證明了螢光PCR的特異性。
靈敏度分析：將突變型細胞系H1650DNA從100納克每微升連續10倍梯度稀釋，分別為100納克每微升，10納克每微升，1納克每微升，100皮克每微升，10皮克每微升，1皮克每微升。每次反應加入5微升DNA。結果表明該發明的螢光PCR方法的靈敏度高，5拷貝DNA基因組即可檢出。
選擇性能力分析：固定每次PCR反應總DNA用量，100納克/反應和10納克/反應。先將突變細胞系（H1650）的DNA和野生型細胞系（H460）DNA濃度都調整為20納克每微升和2納克每微升。這樣每個反應加5微升模板即為100納克/反應和10納克/反應。按下述方法配置模擬DNA模板。
A：50％即為100納克每微升突變細胞DNA。
B：30％取A液60微升後混入40微升100納克每微升H460細胞DNA，震盪混均。
C：20％取A液40微升後混入60微升100納克每微升H460細胞DNA，震盪混均。
D：15％取B液50微升後混入50微升100納克每微升H460細胞DNA，震盪混均。
E：10％取C液50微升後混入50微升100納克每微升H460細胞DNA，震盪混均。
F：5％取E液50微升後混入50微升100納克每微升H460細胞DNA，震盪混均。
G：1％取F液20微升後混入80微升100納克每微升H460細胞DNA，震盪混均。
H：0.5％取G液50微升後混入50微升100納克每微升H460細胞DNA，震盪混均。
I：0.1％取H液20微升後混入80微升100納克每微升H460細胞DNA，震盪混均。
結果表明該發明的螢光PCR方法的選擇性檢測能力為在10納克總DNA中可以檢出5拷貝的突變DNA，檢測能力為0.1％。
重複性試驗：每個反應分別加入突變細胞系H1650DNA10納克、1納克和100皮克，重複10次進行螢光PCR擴增，10次Ct值相差不到0.1個循環。
收集手術切除的肺癌標本，全血和血漿標本以及胸水標本共62例，其中49組織樣品，1例血漿，3例胸水，9例全血。其中男性34例，女性28例。年齡為36-71歲，平均年齡為55歲。
對於外顯子19，該發明檢測結果與DNA測序結果完全一致：62例樣品中有3例發生外顯子19的E746-A750突變，15例正常肺組織對照均為野生型。其中均為2例女性，1例男性，女性和男性分別占了67％和33％。
表4螢光PCR檢測結果與DNA測序結果的比較
外顯子 | 該發明螢光PCR檢測結果 | DNA測序 | ||||
男性 | 女性 | 檢出率 | 男性 | 女性 | 檢出率 | |
外顯子19 | 2（67%） | 1（33%） | 3/62 | 2（67%） | 1（33%） | 3/62 |
《用於檢測人類EGFR基因突變的引物、探針及其使用方法》單個PCR反應就可以同時檢測EGFR外顯子19的19種缺失，檢測時間僅需100分鐘，因此該發明省時省力，準確性高，可滿足突變的快速診斷。而且，螢光PCR方法和傳統測序方法結果的符合率為100％，螢光PCR靈敏度和選擇性檢測能力高於傳統測序方法，10納克樣品DNA中含0.1％的突變DNA即可檢出。
- 實施例2
該實施例中以EGFR基因熱點突變外顯子19上的L747_P753＞S（2240_2257del18）突變為例來分析《用於檢測人類EGFR基因突變的引物、探針及其使用方法》的單管螢光PCR檢測EGFR基因19種缺失突變的方法。實驗用質粒模板1株（含L747_P753＞S突變），細胞系3株，分別為H460（EGFR基因野生型）、293T（EGFR基因野生型）、SW480（EGFR基因野生型）；100份健康的無償獻血者全血樣品、62份臨床肺癌樣品（包括新鮮組織、石蠟切片、胸腔積液、全血）。
利用上述螢光PCR檢測EGFR基因熱點突變外顯子19上的L747_P753＞S（2240_2257del18）突變的方法包括以下步驟：
（1）樣品處理和模板提取質控：樣品適用範圍包括手術切除的新鮮病理組織，甲醛固定石蠟包埋病例組織，石蠟切片，全血，血漿，血清，胸腔積液等標本。新鮮病理組織，取綠豆大小，約1g重，使用Qiagen公司組織DNA提取試劑盒提取基因組DNA，具體步驟按試劑盒操作說明。蠟塊樣品切成5～8微米切片，取5片，或已經製成的5～8微米切片取5片，經過二甲苯脫蠟後，使用Qiagen公司石蠟包埋DNA提取試劑盒提取基因組DNA，具體步驟按試劑盒操作說明。全血、血漿、血清以及胸腔積液樣品，使用Qiagen公司組織DNA提取試劑盒提取基因組DNA，具體步驟按試劑盒操作說明。每次提取全血200微升，血漿、血清以及胸腔積液不少於800微升。所提DNA溶於Tris-HCl（10毫摩爾每升，pH8.0），經紫外分光光度計檢測提取質量，並確定濃度，用Tris-HCl溶液（10毫摩爾每升，pH8.0）調整DNA濃度到100納克每微升或2納克每微升作為PCR擴增的模板。
（2）螢光PCR擴增，配製反應體系：
1×PCR緩衝液
MgCl2 | dNTP各 | 各對引物 | 各條探針 | Taq酶 | 模板 | 總體積 |
7.0毫摩爾 | 1.0毫摩爾 | 0.1~1.0微摩爾 | 0.5~1.0微摩爾 | 2.5U | 5微升 | 40微升 |
所述螢光PCR的反應條件是95℃預變性5分鐘，15個循環94℃變性15秒，66℃退火40秒，72℃延伸10秒，35個循環94℃變性15秒，56℃退火40秒，72℃延伸10秒，35個循環。
（3）檢測：採用Mx3000P實時PCR擴增儀（StrataGene公司）後35個循環退火階段檢測FAM和HEX或ROX螢光信號，一次可以檢測96份樣品（包括陰陽性對照）。結果判斷：根據螢光PCR擴增儀顯示的Ct值判斷結果：檢測反應體系的FAM和HEX螢光強度，以HEX信號達到設定閾值（Ct＞18）時表明上樣DNA量在允許範圍內，FAM信號結果可信；以FAM達到設定的閾值時所需要的循環次數Ct值作為陰陽性判斷的標準，Ct值為0或35：陰性；Ct小於32：陽性。[0108]前述100份健康獻血者全血樣品以及細胞系H460（EGFR基因野生型）、293T（EGFR基因野生型）、SW480（EGFR基因野生型），突變質粒DNA（帶L747_P753＞S突變）經該發明的體系檢測，只有突變質粒DNA有螢光信號，其他樣品無螢光信號，進一步證明了螢光PCR的特異性。
靈敏度分析：將突變質粒DNA連續10倍梯度稀釋，每次反應加入5微升DNA。結果表明該發明的螢光PCR方法的靈敏度高，5拷貝DNA基因組即可檢出。
選擇性能力分析：固定每次PCR反應總DNA用量，100納克/反應和10納克/反應。先將野生型細胞系（H460）DNA濃度都調整為20納克每微升和2納克每微升。這樣每個反應加5微升模板即為100納克/反應和10納克/反應。然後將105拷貝/微升的突變質粒DNA用20納克每微升和2納克每微升的H460DNA連續10倍稀釋。
結果表明該發明的螢光PCR方法的選擇性檢測能力為在10納克總DNA中可以檢出5拷貝的突變DNA，檢測能力為0.1％。
重複性試驗：每個反應分別加入突變質粒DNA1000拷貝、100拷貝和10拷貝，重複10次進行螢光PCR擴增，10次Ct值相差不到0.1個循環。
收集手術切除的肺癌標本，全血和血漿標本以及胸水標本共62例，其中49組織樣品，1例血漿，3例胸水，9例全血。其中男性34例，女性28例。年齡為36-71歲，平均年齡為55歲。
對於外顯子19，該發明檢測結果與DNA測序結果完全一致：62例樣品中有3例發生外顯子19的缺失突變，15例正常肺組織對照均為野生型。其中均為2例女性，1例男性，女性和男性分別占了67％和33％。
表4螢光PCR檢測結果與DNA測序結果的比較
外顯子 | 該發明螢光PCR檢測結果 | DNA測序 | ||||
男性 | 女性 | 檢出率 | 男性 | 女性 | 檢出率 | |
外顯子19 | 2（67%） | 1（33%） | 3/62 | 2（67%） | 1（33%） | 3/62 |
《用於檢測人類EGFR基因突變的引物、探針及其使用方法》單個PCR反應就可以同時檢測EGFR外顯子19的19種缺失，檢測時間僅需100分鐘，因此該發明省時省力，準確性高，可滿足突變的快速診斷。而且，螢光PCR方法和傳統測序方法結果的符合率為100％，螢光PCR靈敏度和選擇性檢測能力高於傳統測序方法，10納克樣品DNA中含0.1％的突變DNA即可檢出。
- 實施例3
該實施例中以EGFR基因熱點突變外顯子19上的E746_T751del（2236_2253del18）突變為例來分析《用於檢測人類EGFR基因突變的引物、探針及其使用方法》的單管螢光PCR檢測EGFR基因19種缺失突變的方法。實驗用質粒模板1株（含E746_T751del突變），細胞系3株，分別為H460（EGFR基因野生型）、293T（EGFR基因野生型）、SW480（EGFR基因野生型）；100份健康的無償獻血者全血樣品、62份臨床肺癌樣品（包括新鮮組織、石蠟切片、胸腔積液、全血）。
利用上述螢光PCR檢測EGFR基因熱點突變外顯子19上的L747_P753＞S（2240_2257del18）突變的方法包括以下步驟：
（1）樣品處理和模板提取質控：
樣品適用範圍包括手術切除的新鮮病理組織，甲醛固定石蠟包埋病例組織，石蠟切片，全血，血漿，血清，胸腔積液等標本。新鮮病理組織，取綠豆大小，約1克重，使用Qiagen公司組織DNA提取試劑盒提取基因組DNA，具體步驟按試劑盒操作說明。蠟塊樣品切成5～8微米切片，取5片，或已經製成的5～8微米片取5片，經過二甲苯脫蠟後，使用Qiagen公司石蠟包埋DNA提取試劑盒提取基因組DNA，具體步驟按試劑盒操作說明。全血、血漿、血清以及胸腔積液樣品，使用Qiagen公司組織DNA提取試劑盒提取基因組DNA，具體步驟按試劑盒操作說明。每次提取全血200微升，血漿、血清以及胸腔積液不少於800微升。所提DNA溶於Tris-HCl（10毫摩爾每升，pH8.0），經紫外分光光度計檢測提取質量，並確定濃度，用Tris-HCl溶液（10毫摩爾每升，pH8.0）調整DNA濃度到100納克每微升或2納克每微升作為PCR擴增的模板。
（2）螢光PCR擴增，配製反應體系
MgCl2 | dNTP各 | 各對引物 | 各條探針 | Taq酶 | 模板 | 總體積 |
1.0毫摩爾 | 1.0毫摩爾 | 0.1~1.0微摩爾 | 0.5~1.0微摩爾 | 2.5U | 5微升 | 40微升 |
所述螢光PCR的反應條件是95℃預變性5分鐘，15個循環94℃變性15秒，66℃退火40秒，72℃延伸10秒，35個循環94℃變性15秒，56℃退火40秒，72℃延伸10秒，35個循環。
（3）檢測：採用Mx3000P實時PCR擴增儀（StrataGene公司）後35個循環退火階段檢測FAM和HEX或ROX螢光信號，一次可以檢測96份樣品（包括陰陽性對照）。結果判斷：根據螢光PCR擴增儀顯示的Ct值判斷結果：檢測反應體系的FAM和HEX螢光強度，以HEX信號達到設定閾值（Ct＞18）時表明上樣DNA量在允許範圍內，FAM信號結果可信；以FAM達到設定的閾值時所需要的循環次數Ct值作為陰陽性判斷的標準，Ct值為0或35：陰性；Ct小於32：陽性。
前述100份健康獻血者全血樣品以及細胞系H460（EGFR基因野生型）、293T（EGFR基因野生型）、SW480（EGFR基因野生型），突變質粒DNA（帶L747_P753＞S突變）經該發明的體系檢測，只有突變質粒DNA有螢光信號，其他樣品無螢光信號，進一步證明了螢光PCR的特異性。
靈敏度分析：將突變質粒DNA連續10倍梯度稀釋。每次反應加入5微升DNA。結果表明該發明的螢光PCR方法的靈敏度高，5拷貝DNA基因組即可檢出。
選擇性能力分析：固定每次PCR反應總DNA用量，100納克/反應和10納克/反應。先將野生型細胞系（H460）DNA濃度都調整為20納克每微升和2納克每微升。這樣每個反應加5微升模板即為100納克/反應和10納克/反應。然後將105拷貝/微升的突變質粒DNA用20納克每微升和2納克每微升的H460DNA連續10倍稀釋。
結果表明該發明的螢光PCR方法的選擇性檢測能力為在10納克總DNA中可以檢出5拷貝的突變DNA，檢測能力為0.1％。
重複性試驗：每個反應分別加入突變質粒DNA1000拷貝、100拷貝和10拷貝，重複10次進行螢光PCR擴增，10次Ct值相差不到0.1個循環。
收集手術切除的肺癌標本，全血和血漿標本以及胸水標本共62例，其中49組織樣品，1例血漿，3例胸水，9例全血。其中男性34例，女性28例。年齡為36-71歲，平均年齡為55歲。
對於外顯子19，該發明檢測結果與DNA測序結果完全一致：62例樣品中有3例發生外顯子19的缺失突變，15例正常肺組織對照均為野生型。其中均為2例女性，1例男性，女性和男性分別占了67％和33％。
表4螢光PCR檢測結果與DNA測序結果的比較
外顯子 | 該發明螢光PCR檢測結果 | DNA測序 | ||||
男性 | 女性 | 檢出率 | 男性 | 女性 | 檢出率 | |
外顯子19 | 2（67%） | 1（33%） | 3/62 | 2（67%） | 1（33%） | 3/62 |
《用於檢測人類EGFR基因突變的引物、探針及其使用方法》單個PCR反應就可以同時檢測EGFR外顯子19的19種缺失，檢測時間僅需100分鐘，因此該發明省時省力，準確性高，可滿足突變的快速診斷。而且，螢光PCR方法和傳統測序方法結果的符合率為100％，螢光PCR靈敏度和選擇性檢測能力高於傳統測序方法，10納克樣品DNA中含0.1％的突變DNA即可檢出。
序列表見下表格：
榮譽表彰
2020年7月，《用於檢測人類EGFR基因突變的引物、探針及其使用方法》獲得第二十一屆中國專利銀獎。
