《生防芽孢桿菌幾丁質酶表達調節的分子基礎》是依託南開大學，由陳月華擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：生防芽孢桿菌幾丁質酶表達調節的分子基礎
- 項目類別：面上項目
- 項目負責人：陳月華
- 依託單位：南開大學
中文摘要,結題摘要,
中文摘要
從蘇雲金芽孢桿菌幾丁質酶合成調節方式的多樣性入手，以不同表達類型的幾丁質酶基因（chi）為研究對象，通過有針對性地誘變和缺失調節區域鹼基而改變原基因表達方式的手段，確定幾丁質酶基因調節區的遺傳元件，尋找影響幾丁質酶基因啟動子效率的關鍵鹼基，有可能從基因調節區域的特點揭示細菌組成型及誘導型合成幾丁質酶的轉錄調節規律,為Bt幾丁質酶儘早用於生物防治奠定基礎。研究內容包括：克隆一系列典型組成型和誘導型chi全長基因，包括ORF及上游完整的調節區域，在E.coli中異源表達。預測出潛在的啟動子序列，確定不同表達類型基因調節區域內在的規律性和鹼基差異，有針對性地進行定點誘變和啟動子的系列鹼基缺失。誘變後在酶合成及mRNA轉錄水平上觀察基因在表達方式上的變化。最終確定幾丁質酶組成型、誘導型表達的各自基因啟動子序列和其它遺傳元件，確定芽孢桿菌chi基因表達方式的最小調節區域及其關鍵調節位點。
結題摘要
本研究旨在確定Bt幾丁質酶表達方式的基礎上，研究該基因的遺傳調控元件，從而為揭示幾丁質酶基因表達調節機理提供理論依據。 為了對生防芽孢桿菌幾丁質酶的表達方式有系統、全面的了解，採用DNS法檢測了104株菌在有或無誘導物培養基中的幾丁質酶活力，經過對數據的歸納分析後，首次發現了芽胞桿菌幾丁質酶基因表達調控的多態現象。 為研究chi基因表達調節的分子基礎，需要構建一個帶有無啟動子報告基因的載體。將基因bgaB作為報告基因，在穿梭載體pHT315的骨架上構建了載體pCB。並證明該載體完全可以開展本研究計畫的後續所有工作。 通過對chiA調控序列的一系列缺失突變子對酶活力影響的分析，發現調控區域中長75 bp的序列是chiA基因的核心啟動子。研究發現和證實在核心啟動子下游、-20 bp處上游附近存在一個應答幾丁質誘導的負調控位點，缺失或破壞這個位點導致chiA啟動子引起酶的組成型表達。另外，通過5′RACE技術，證實chiA啟動子內 -46 bp處的“A”鹼基是基因的轉錄起始位點，由此確定chiA啟動子的-35區和-10區分別為“TTACAA”和“TATCAT”，間隔17 bp。 通過對chiB調控序列的一系列缺失突變子對酶活力影響的分析，證實chiB調控序列中112bp，既從上游-232至-121 bp位點之間的序列為基因的核心啟動子。同時證實chiB基因轉錄起始位點為-132 bp處的“C”鹼基。chiB基因啟動子的-35區和-10區序列分別為“TTTACA”和“TACGAT”，間隔17 bp。 缺失分析發現，chiB基因記憶體在一個16 bp應答幾丁質誘導的負調控位點—dre(AGACTTCGTGATGTCT)。該位點是一個保守序列，具有部分反向重複序列的特點。缺失或部分缺失這個序列導致chiB啟動子為組成型表達，因此證實dre位點參與了chiB基因誘導表達的調節，通過體外凝膠電泳遷移率變動分析證實，Bt存在一種蛋白，在無誘導物的情況下能夠結合包括dre位點在內的調控區域。同時發現和證明，其中一些鹼基對於dre位點行使功能起著至關重要的作用。上述有關chiA、chiB基因表達調節關鍵遺傳元件的研究結果，為深入研究調控蛋白，為最終提出Bt幾丁質酶表達調控模型提供了研究基礎。
