甘藍型油菜組織特異型啟動子的分離與鑑定

《甘藍型油菜組織特異型啟動子的分離與鑑定》是依託西南大學，由盧坤擔任項目負責人的青年科學基金項目。

基本介紹

• 中文名：甘藍型油菜組織特異型啟動子的分離與鑑定
• 項目類別：青年科學基金項目
• 項目負責人：盧坤
• 依託單位：西南大學

項目摘要

甘藍型油菜是我國最重要的油料作物之一，對其抗性和光合效率等性狀進行基因工程改良，可促進我國南方冬閒田油菜的發展，保障食用油的供給安全。組織特異型啟動子能驅動外源基因在特定組織器官中高效表達，對作物品質改良，提高抗性和產量等方面具有重要作用。項目前期分析了甘藍型油菜和擬南芥基因表達譜，篩選了油菜根、莖稈、葉片和角果皮特異表達基因各1個，獲得了基因的啟動子序列。後續研究將利用RT-PCR檢測基因在油菜中的組織特異性；5′RACE定位基因的轉錄起始位點；構建promoter-GUS載體轉化甘藍型油菜，明確啟動子在油菜基因工程中的作用；以啟動子缺失載體轉化擬南芥確定組織特異表達的核心序列；凝膠阻滯實驗和啟動子點突變載體的瞬時表達鑑定順式元件的位置與功能。研究結果有助於深入理解甘藍型油菜中啟動子調控基因轉錄的調控機制及組織特異表達的本質，對油菜及近緣物種基因工程改良具有重要的理論意義和實踐意義。

結題摘要

甘藍型油菜是我國最重要的油料作物之一，對其抗性和光合效率等性狀進行基因工程改良，可促進我國南方冬閒田油菜的發展，保障食用油的供給安全。組織特異型啟動子能驅動外源基因在特定組織器官中高效表達，對作物品質改良，提高抗性和產量等方面具有重要作用。項目利用擬南芥、白菜和甘藍基因表達譜數據進行了深入的生物信息學分析，篩選了48個組織特異表達候選基因，其中葉、根和莖特異表達基因分別為7個、4個和10個，蕾和花特異表達基因各4個，角果皮和種皮特異表達基因分別為6個和2個，種子特異表達基因5個，根莖葉特異表達基因6個。根據白菜和甘藍中特異表達基因保守序列設計了實時定量PCR檢測引物，以分析基因在甘藍型油菜中油821 DH系10個組織器官（根、子葉、下胚軸、莖幹、葉片、蕾、花、角果皮、花後15和45天種子）中的表達模式。檢測結果共獲得了單一組織器官中特異表達的基因12個及兩個以上組織器官中特異表達的基因11個。擴增片段測序結果證實了擴增條帶來自候選基因。5′RACE擴增明確了特異表達基因轉錄起始位點位於起始密碼子ATG上游26-175 bp處。啟動子克隆結果表明啟動子長度分別為1300-2396 bp，與甘藍型油菜基因組序列一致性為98.0%-100%，表明我們已成功獲得這些基因的上游啟動子序列。利用酶切連線構建上述啟動子的promoter-GUS載體，測序鑑定後轉化農桿菌感受態獲得轉基因工程菌株。利用農桿菌介導轉化油菜下胚軸的方法，我們獲得了種子特異表達基因BnCDD、花特異表達基因BnHABF和葉片特異表達基因BnMAPK10的promoter-GUS載體T2代純合轉基因植株，其他載體也正在通過農桿菌介導轉化和浸花法轉化甘藍型油菜以繼續研究這些基因啟動子的功能。轉基因陽性植株GUS染色結果表明，BnCDD、BnHABF和BnMAPK10基因啟動子分別在種子、花和葉片中具有GUS活性，證實了這些啟動子為不同組織器官的特異啟動子。順式調節元件分析表明4個種子特異表達基因啟動子均存在胚乳表達的Skn-1_motif，而BnCAMS1啟動子中還存在胚乳表達的GCN4_motif，提示啟動子中的組織特異表達順式調節元件可能參與其表達模式調節。本研究獲得的組織特異啟動子將為我國油菜基因工程改良提供具有自主智慧財產權的組織特異啟動子資源，對油菜及近緣物種的基因功能研究和基因工程育種具有重要意義。