球蟲卵囊壁蛋白的鑑定與形成機制的研究

《球蟲卵囊壁蛋白的鑑定與形成機制的研究》是依託揚州大學，由劉丹丹擔任項目負責人的青年科學基金項目。

基本介紹

• 中文名：球蟲卵囊壁蛋白的鑑定與形成機制的研究
• 項目類別：青年科學基金項目
• 項目負責人：劉丹丹
• 依託單位：揚州大學

項目摘要

雞球蟲病是由艾美耳球蟲引起的一種嚴重危害養雞業的寄生蟲病，毒害艾美耳球蟲是引起雞小腸球蟲病的主要病原。卵囊是球蟲類寄生蟲在宿主間傳播的一個發育階段，由受精的大配子發育而成，其囊壁是由位於球蟲大配子體中的成壁體內容物相續釋放形成。卵囊壁主要由蛋白質組成，由位於成壁體中的前體蛋白形成，但僅有極少數蛋白被鑑定和研究。卵囊壁對球蟲類寄生蟲的生存與傳播十分重要，故對卵囊壁蛋白及其前體蛋白的深入研究是尋找防治球蟲病的一個重要切入點。為此，本研究以雞的毒害艾美耳球蟲為研究對象，首先套用雙向凝膠電泳—質譜技術分離與鑑定卵囊壁蛋白與成壁體蛋白；隨後，套用生物信息學方法比較兩者的蛋白質組成與功能，尋找卵囊壁蛋白的前體蛋白；接著套用RT-PCR和RACE技術克隆相關基因，體外重組表達，製備多抗，套用雷射共聚焦等技術予以驗證；最後解析卵囊壁蛋白形成的分子基礎與機制，為尋找殺滅或抑制卵囊形成的分子靶點奠定基礎。

結題摘要

卵囊壁是球蟲類寄生蟲抵抗外界不良環境、長期存活的一個重要保護屏障。而卵囊壁主要由配子體內的成壁體發育而成，解析成壁體參與卵囊壁形成的分子機制將有利於尋找殺滅或抑制卵囊形成的靶點，從而為雞球蟲病的防治提供新策略。本項目在建立了卵囊壁和成壁體分離純化方法的基礎上，提取了卵囊壁和成壁體總蛋白進行TMT標記蛋白質譜分析，獲得了差異表達蛋白。經GO、KEGG和COG富集分析，獲得了與卵囊壁形成相關的差異蛋白信息，並通過克隆表達和雷射共聚焦免疫螢光定位技術進行了功能驗證。通過蛋白組學分析，共篩選到差異蛋白1002個，其中，301個蛋白富集到29個GO條目中，599個差異蛋白富集到33個KEGG代謝途徑中，391個蛋白被歸類到21個COG簇中，且這些差異蛋白主要集中於細胞大分子複合物組裝、蛋白質摺疊，氧化還原酶複合物，二硫化物還原酶活性，輔酶生物合成過程，蛋白酶體複合物，過氧化物酶體等與翻譯後修飾、蛋白質轉換、碳水化合物運輸和代謝等相關的功能。最後，篩選了EnGAM56和EnGAM59蛋白進行體外克隆表達，經免疫螢光定位顯示，此2種蛋白均位於卵囊壁和成壁體中，經全自動Western blot分析顯示，此2種蛋白均在卵囊壁中低表達，成壁體中高表達，與蛋白組學數據分析結果一致，預示成壁體蛋白參與了卵囊壁的形成。本項目研究結果為進一步解析卵囊壁形成的分子機制奠定了重要理論基礎，也為雞球蟲亞單位疫苗的研製提供了候選基因。