《狂犬病病毒L蛋白轉錄酶與複製酶的活性調控研究》是依託中國人民解放軍軍事科學院軍事醫學研究院，由龔文杰擔任項目負責人的青年科學基金項目。
基本介紹
- 中文名：狂犬病病毒L蛋白轉錄酶與複製酶的活性調控研究
- 項目類別：青年科學基金項目
- 項目負責人：龔文杰
- 依託單位：中國人民解放軍軍事科學院軍事醫學研究院
中文摘要,結題摘要,
中文摘要
狂犬病病毒(Rabies virus, RABV)為彈狀病毒科狂犬病病毒屬成員，其聚合酶蛋白（L蛋白）是RABV基因組RNA複製與轉錄唯一的聚合酶。研究表明，RABV基因表達及基因組複製受到嚴格調控以逃避宿主的監視。為了深入了解L蛋白轉錄酶與複製酶的活性調控機制，本研究利用免疫共沉澱、蛋白免疫印跡、小RNA分子深度測序和Northern blot等技術，鑑定與L蛋白相互作用的宿主蛋白及小RNA分子。通過RNA干擾、表達細胞系構建及病毒L蛋白與宿主蛋白和小RNA分子之間的相互作用來分析這些調控因子對L蛋白活性的調控機制。本研究對RABV基因組複製的深入研究有助於開發狂犬病的靶向預防製劑，具有重要的科學意義及理論價值。
結題摘要
狂犬病是由狂犬病病毒引起的重要人獸共患傳染病。在我國，狂犬病是一個嚴重的公共衛生問題。因此，深入闡釋狂犬病病毒的複製機理對防治狂犬病具有重要意義。狂犬病病毒是一個具有囊膜的不分節段的單股負鏈RNA病毒，主要編碼核蛋白（N），磷蛋白（P），基質蛋白（M），糖蛋白（G）和聚合酶蛋白（L）。病毒粒子由外部含有G蛋白和M蛋白的囊膜以及內部N、P、L蛋白和基因組RNA構成的核糖核蛋白複合物（ribonucleoprotein, RNP）組成。RNP所含病毒組分與相應宿主蛋白結合後形成病毒複製複合物以調節病毒複製。 狂犬病病毒粒子在胞內組裝時與RNP互作的宿主蛋白也可能被包裝入病毒粒子。為了揭示病毒粒子的宿主蛋白組成，本研究利用蔗糖密度梯度離心純化了狂犬病病毒 SRV9弱毒疫苗株，純化的病毒粒子經LC-MS/MS檢測發現，除了五個病毒結構蛋白以外，病毒粒子還攜帶有50個宿主蛋白，根據蛋白功能將其分成十類：胞內轉運蛋白，分子伴侶，細胞骨架蛋白，信號轉導蛋白，轉錄調節蛋白，鈣離子結合蛋白，酶結合蛋白，代謝作用蛋白，泛素化蛋白和其他功能的蛋白。為篩選與N蛋白和P蛋白互作的宿主蛋白，原核表達了重組P蛋白並製備了鼠源多克隆抗體，同時構建了表達狂犬病病毒N蛋白和P蛋白的BHK-21細胞系。免疫螢光試驗發現N蛋白主要定位於穩定細胞系的胞核，而P蛋白主要定位於細胞系的胞質，同時穩定細胞系中N和P蛋白表達均能抑制狂犬病病毒的增殖。利用串聯親和純化TAP從構建的BHK-21細胞系裂解液中分離與N、P蛋白互作的宿主蛋白。LC-MS/MS檢測獲得了41個和21個分別與N蛋白和P蛋白互作的宿主蛋白。進一步比較狂犬病病毒粒子的蛋白質譜以及與N和P蛋白互作的宿主蛋白發現，8個與N蛋白互作和5個與P蛋白互作的宿主蛋白存在於狂犬病病毒粒子上。與N和P蛋白互作且位於病毒粒子上的宿主蛋白調控病毒複製與感染的機制將是項目後續研究的重點。 本研究首次鑑定了狂犬病病毒粒子的蛋白質組成以及與N和P蛋白互作的宿主蛋白，為進一步研究病毒的複製和感染機制奠定了基礎。
