烏桕DGAT1和DGAT2調控油脂積累的分子機理解析

《烏桕DGAT1和DGAT2調控油脂積累的分子機理解析》是周波為項目負責人，中南林業科技大學為依託單位的青年科學基金項目。

基本介紹

• 中文名：烏桕DGAT1和DGAT2調控油脂積累的分子機理解析
• 項目類別：青年科學基金項目
• 項目負責人：周波
• 依託單位：中南林業科技大學

項目摘要

烏桕是原產我國的重要木本油料樹種，果仁含油率高達65.76％，烏桕梓油是製造生物柴油的理想原料，有關烏桕含油率高的機理，至今未見相關報導。DGAT酶是促進油脂積累的重要因子。本項目擬採用同源克隆的方法從烏桕克隆出油脂合成的關鍵酶基因DGAT1和DGAT2。通過螢光定量PCR從轉錄水平明確這兩個基因的表達與油脂積累的關聯性關係；採用western blot從翻譯水平確定這兩個蛋白的表達豐度與油脂積累的關聯性關係；通過啟動子分析闡明這兩個基因的時空表達模式與油脂積累的調控關係。採用反向遺傳學的方法在甘藍型油菜中表達這兩個基因，明確其在油脂積累過程中的關鍵作用。最終從基因的轉錄、調控和蛋白質的表達等多層面解析DGAT調控烏桕油脂積累的分子機制。研究成果為木本油料樹種油脂積累的分子機理研究奠定理論基礎，並為烏桕品種改良提供技術支持。

結題摘要

烏桕梓油是製造生物柴油的理想原料。有關烏桕含油率高的機理，至今未見相關報導。 DGAT酶是促進油脂積累的重要因子。本項目採用RACE技術從烏桕種子中克隆出了調控油脂合成的兩個關鍵酶基因SsDGAT1和SsDGAT2。SsDGAT1的全長CDS序列為1524bp, 編碼507aa。SsDGAT2的全長CDS序列為1101bp, 編碼336aa。通過酶切連線的方法構建了pYES2-SsDGAT1和pYES2-SsDGAT2酵母表達載體，將這兩個載體分別轉進DGAT缺失的酵母突變體中，結果都能彌補TAG合成的缺陷，說明SsDGAT1和SsDGAT2都具有DGAT酶的活性。亞細胞定位結果顯示SsDGAT1和SsDGAT2都定位在內質網中。以不同發育時期的烏桕種子為材料，通過螢光定量PCR從轉錄水平明確了這兩個基因的表達量是先隨著種子的發育是先增加後降低，SsDGAT1的表達峰值在種子開始形成後100天左右，SsDGAT2的表達峰值在種子開始形成後90天左右。採用Western blot從翻譯水平明確了隨著這兩個蛋白的表達豐度的是隨著種子的不斷發育先增加後降低，SsDGAT1在10月中旬的烏桕種子表達量最高，SsDGAT2在9月下旬的烏桕種子表達量最高。採用染色體步移的方法克隆了SsDGAT1和SsDGAT2的啟動子，通過Gateway克隆的方法分別構建了這兩個基因的啟動子驅動GUS表達的載體，藉助農桿菌介導的方法轉化了甘藍型油菜，通過GUS染色分析發現SsDGAT1和SsDGAT2在種子中的時空表達模式是先增加後降低，而烏桕種子油脂積累隨著種子的發育不斷增加；採用反向遺傳學的方法在甘藍型油菜中表達這兩個基因，明確了SsDGAT1在油菜種子開始形成的20天左右表達量達到峰值，SsDGAT2在油菜種子開始形成的15天左右表達量達到峰值。SsDGAT1轉基因油菜種子的含油量增加了6%-7%，SsDGAT2轉基因油菜種子的含油量增加了3%-4%。 研究成果為烏桕分子育種奠定理論基礎。