海洋噬菌體及其聚糖降解酶的研究與套用

《海洋噬菌體及其聚糖降解酶的研究與套用》是依託中國海洋大學，由牟海津擔任項目負責人的面上項目。

基本介紹

• 中文名：海洋噬菌體及其聚糖降解酶的研究與套用
• 項目類別：面上項目
• 項目負責人：牟海津
• 依託單位：中國海洋大學

中文摘要

海洋細菌胞外多糖是一種結構新穎、功能獨特的海洋天然產物，通常是由具有特定序列的重複單位構成；而噬菌體在侵染宿主細胞過程中釋放出的聚糖降解酶，能夠特異性作用於宿主胞外多糖，通過酶解作用使其中的重複序列得以釋放，從而產生結構新型的寡糖。本項目計畫以海洋噬菌體及其聚糖降解酶為研究對象，從海洋噬菌體中提取並純化出高效聚糖降解酶，確定噬菌體聚糖降解酶的酶學性質和化學結構；以海洋細菌胞外多糖為底物進行酶解反應，分析酶解產物的組成和結構，以確定聚糖降解酶的作用特點；並完成噬菌體聚糖降解酶在原核生物細胞中的克隆表達。本項目擬在為未來多種類型的海洋噬菌體聚糖降解酶的批量製備、致病菌生物膜的研究與破壞以及新型功能寡糖的開發，探索出一種行之有效的新途徑和新方法。

結題摘要

海洋細菌胞外多糖是一種結構新穎、功能獨特的海洋天然產物，通常是由具有特定序列的重複單位構成；而噬菌體在侵染宿主細胞過程中釋放出的聚糖降解酶，能夠特異性作用於宿主胞外多糖，通過酶解作用使其中的重複序列得以釋放，從而產生結構新型的寡糖。本項目從海洋環境中篩選出20餘株噬菌體，以Klebsiella K13的噬菌體聚糖酶為工具，對Klebsiella K13胞外多糖進行降解，得到產物穩定的小分子量寡糖。酶解產物經Bio-Gel P4凝膠柱及Bio-Gel P6凝膠柱分離純化，得到三個低分子量的組分。通過氣相色譜分析對胞外多糖的單糖組分進行分析，發現此胞外多糖由葡萄糖、甘露糖和半乳糖三種單糖組成。藉助於ESI-CID-MS分析，確定了各寡糖組分的分子量，並確定各片段分別為五糖、十糖、十五糖。經紅外光譜分析，發現寡糖含有糖醛酸等特徵官能團。通過一維核磁共振波譜分析和二維核磁共振波譜分析，確定了寡糖組分的基本結構。 噬菌體P13潛伏期約為20 min，爆發期約為40 min，屬於烈性噬菌體。形態學分析發現其頭部直徑約為50 nm，並具有較短的尾部。採用高通量測序法對其基因組序列進行測定並研究其結構特徵，發現基因組長度為45 976 bp，為線性雙鏈DNA。對噬菌體P13基因組的生物信息學進行分析，發現在P13基因組中共具有282個長度大於100bp的ORFs，其中有50個ORFs為假定基因，基因總長度為41 329 bp，基因平均長度為833 bp。在50個假定基因中，有40個基因可找到同源性序列，其中26個基因已確定了功能，推斷出基因49及基因50為可能的多糖解聚酶基因。基於分子生物學實驗方法，已成功構建了含有目的基因重組質粒的工程菌。 噬菌體聚糖酶對生物被膜具有顯著降解作用，平板擦拭計數法顯示酶處理4h對生物被膜細菌數量的影響最為顯著，80%的細菌被清除。噬菌體聚糖酶預處理還可有效提高消毒劑二氧化氯對生物被膜細菌的清除率。實驗通過掃描電鏡（SEM）觀察酶處理不同時間的生物被膜細菌及胞外多糖的結構變化、單位面積生物被膜細菌群落數量的變化，觀察結果表明，噬菌體聚糖酶能夠有效減少處於連結狀態的細菌和生物被膜中的胞外物質，噬菌體聚糖酶對生物被膜具有高效的降解性能，有可能開發成為一種去除生物被膜的重要工具。