《活細胞近膜區域分子相互作用無標記實時檢測方法》是依託清華大學，由余興龍擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：活細胞近膜區域分子相互作用無標記實時檢測方法
- 依託單位：清華大學
- 項目負責人：餘興龍
- 項目類別：面上項目
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
活細胞膜表面的分子表型信息的獲取能夠為細胞組學研究和藥物發現提供可靠的依據，相應的檢測方法亟需有新的突破。基於SPR感測，建立細胞層次上分子水平檢測的數學模型，研究多波長的光源對細胞進行分層檢測的機理，製備可重複使用的活細胞晶片，構建高靈敏度、實時、無標記和螢光標記兩用的活細胞檢測系統，設計感測信號實時採集、處理算法與軟體。在此基礎上，以胃癌細胞BGC823和AGS等為模型，開展在細胞周期不同時期如Go、G1、S和G2/M等的細胞形態與膜蛋白水平的差異、細胞近膜區域中膜蛋白S100A14和EGFR與相應配體的相互作用、由其引發的胞內分子回響以及胃癌化療藥物如5-FU對活細胞刺激的檢測實驗，積累和解析實驗數據，並與Western Bolt及ELISA方法進行對比，初步找出胃癌相關的特徵數據，為膜蛋白組學提供新數據，為胃癌診斷、治療及藥物篩選提供依據，為細胞組學研究提供新方法和新工具。
結題摘要
細胞內分子間相互作用的檢測對研究分子功能及其作用機制，發現新的藥靶具有重要意義。本項目基於SPR感測，針對生物分子與細胞相互作用的特點，構建了2種實驗裝置，實現了活細胞動態變化的實時檢測。 理論方面，通過分析SPW的穿透深度與激發光波長等關係，明確了激發波長越長，倏逝波場在感測層中的穿透越深，可選擇不同激發波長來表征細胞不同深度的信息。接著，建立了SPR感測檢測細胞的物理模型，研究表明，不同波長光所激發的SPR對相同感測層的靈敏度不同；同一波長對不同感測層的靈敏度不同。因此，可採用雙波長或多波長同時檢測，獲得2個或多個不同的SPR感測信號，再根據靈敏度差異進行解算，獲得細胞活動的細微變化信息。 根據理論分析，構建了基於振鏡掃描的單細胞檢測實驗裝置，提出並實現了新穎的相移法解算諧振角法，將ATR曲線變換到了頻域處理，顯著增強抑制噪聲能力，其特點：一是動態範圍大，達到1.33-1.38；二是靈敏度高，可達1.8×10-6RIU，能檢測各種細胞與小分子相互作用。同時，在所研製的“高通量相位檢測生物分子相互作用分析儀”的基礎上，構建了多細胞及單細胞陣列的檢測裝置，設計了專用於細胞檢測的恆溫控制微流體系統，有利於細胞的晶片上培養。 細胞晶片是檢測的基礎。分析了現有晶片修飾方法後，設計了6種方法進行對比實驗，優選出了最佳的一種：先在金膜上鍍SiO2膜，再包被PLL，既可保護金膜，又能構建親水基底，促進細胞貼附，縮短培養時間，維持細胞活性。並且，最佳化了細胞晶片的製備方法和相關條件。測試細胞的片上培養狀態後，又完成了2種檢測： 在正常和固定的人胃癌BGC823細胞上，進行其膜蛋白EGFR與對應抗體EGFR1相互作用的檢測，與免疫螢光實驗對照，結果表明能敏感地檢測到細胞表面的分子反應。 利用抗癌藥物大蒜素，對胃癌BGC823細胞進行刺激，檢測其回響。對照實驗表明，受刺激和未受刺激細胞的SPR信號回響值分別為0.15和0.35 RIRF，差值明顯。結合形態變化觀察，可得出，癌細胞受大蒜素刺激後被抑制，有助於理解和分析大蒜素的抗癌作用機理。 除上述外，還與SFG聯用，檢測了MSI-78與POPC、POPC/POPG磷脂膜的相互作用，綜合研究結果，可得出：當MSI-78濃度達到一定時，能在磷脂膜上形成環形穿孔，破壞磷脂膜，從而導致細胞破裂，這是其抗菌作用的基本機理。
