水稻高葉綠素含量基因Gc的克隆與功能解析

中文摘要

葉綠素是高等植物進行光合作用的重要物質因子,在光合作用的光能吸收、傳遞和轉換中起重要作用。在前期研究中，發現一株水稻高葉綠素突變體，其葉綠素b含量比野生型高1倍以上，遺傳研究表明該性狀為顯性單基因（命名為Gc）控制，目前已將Gc定位於水稻第1染色體87kb的片段上，為克隆Gc基因奠定了基礎。本項目擬在現有基礎上，克隆水稻高葉綠素含量基因Gc，鑑定Gc與水稻葉綠素b含量的關係；從基因的亞細胞定位和時空表達模式、基因在轉錄水平的調控及與Gc產物互作蛋白等方面全面分析Gc基因的功能；通過比較Gc突變體與野生型葉綠體的超微結構、葉綠素前體物質的合成動態、其它葉綠素合成相關基因的表達量、葉綠體類囊體膜的蛋白質組學等方面來探索高葉綠素Gc突變體高光效的分子機制。該研究在理論上對於全面了解植物光合作用的分子機制有重大意義；在實踐上對於水稻乃至其他禾本科作物的高產優質育種具有重大的經濟價值。

結題摘要

1. 克隆了水稻高葉綠素含量基因Gc，序列分析表明該基因為植物基因DET1的同源物（命名為OsDET1）。 2. 序列分析顯示，在突變體(Gc)中，OsDET1的突變發生在兩個位置：第7個外顯子上983位的T突變為C，導致胺基酸由亮氨酸(Leu)突變為絲氨酸(Ser)；在啟動子區域-214及-647bp兩處處分別有11個鹼基片段的插入，而在-272bp處有26個鹼基片段的缺失。初步推斷，胺基酸序列的改變導致了OsDET1蛋白性質發生變化，而啟動子區域的突變改變了該區域的順式作用元件，從而造成突變體(Gc)和野生型啟動子的啟動能力差異； 3. 通過互補實驗表明：OsDET1的突變(包括啟動子插入缺失突變及編碼區單鹼基突變)的引起了水稻葉綠素b含量的提高。 4. 時空表達分析結果表明：OsDET1在水稻的四個生育期苗期、分櫱期、揚花期及成熟期表達量均比較高，且主要集中在水稻的綠色組織（葉片和葉鞘）表達；OsDET1在突變體(Gc)中表達量顯著高於在野生型中的表達量，推測其參與水稻的光合作用。此外OsDET1表達特徵具有節律性。 5. 洋蔥表皮的亞細胞定位結果表明：OsDET1定位於細胞核。 6. 蛋白互作的初步研究表明，與OsDET1互作的蛋白是光系統II參與光合作用的蛋白如鐵氧還蛋白質、體藍素及泛素等。已有報導鐵氧還蛋白及質體藍素是植物光合作用中的關鍵蛋白；而泛素參與植物的光損傷修復。 7. 調控序列結果表明：啟動子區域的插入及缺失突變導致了啟動子的啟動能力增強； 8. 突變體(Gc)高光效的分子機制表明：與野生型相比，高葉綠素突變體(Gc):(1)葉綠素b含量及葉片的淨光合速率顯著增高，氣孔導度顯著降低；(2) PSII的螢光參數均升高；(3)葉綠體中的基粒類囊體垛疊明顯增厚，有的基粒類囊體有膨大現象，說明突變體(Gc)的類囊體膜的裝配可能發生了改變；(4)葉片中δ-氨基乙醯丙酸(ALA)、膽色素原(PBG)，尿卟啉原III(UrogenIII)及糞卟啉原(CoprogenⅢ) 含量增加；(5)葉片中葉綠素a/b結合蛋白基因（CAB1R和CAB2R）、鎂螯合酶基因CHLH和谷氨酸-tRNA還原酶基因HEMA1表達增高；(6) PSI反應中心PsaA和 PsaB亞基, PSII 47 kDa蛋白,、43kDa蛋白及PsaA表達量顯著增加

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