基本介紹
- 中文名：正相色譜
- 外文名：Normal phase chromatography
- 原理：根據分子的極性大小
- 填料：矽膠、極性鍵合相等
定義,適合樣品,原理,種類與性質,色譜柱,參數,
定義
液相色譜有正相和反相之分。正相色譜和反相色譜還有吸附色譜和極性化學鍵鍵合色譜之分。如果採用固定相的極性大於流動相的極性，就稱為正相色譜；如果固定相的極性小於流動相的極性，則稱為反相色譜。由於極性化合物更容易被極性固定相所保留，所以正相色譜系統一般適用於分離極性化合物，極性小的組分先流出。相反，反相色譜系統一般適用於分離非極性或弱極性化合物，極性大的組分先流出。另外，其他有些色譜如柱色譜也有正反相之分。正相色譜主要適用於非極性至中等極性的中小分子化合物的分離，在生化分析中主要套用於脂溶性維生素、甾體激素、醫藥等的分離分析；在農藥、石油化工、精細化工、環境分析等方面也有廣泛的套用。
正相色譜基本上可以被看做是液固吸附色譜，其柱填料是吸附劑，其表面上分布有活性吸附位點，溶劑和溶質分子均能被吸附於活性位點上。由於相互作用力有大有小，溶劑分子與溶質分子、溶質分子相互之間又存在競爭吸附，從而造成了在柱內保留時間的差異，使不同物質得到分離。
適合樣品
正相色譜一般用來分離中性化合物和離子(或可電離的)化合物，而且以中性樣品為主。適於分離樣品如下：①對於反相色譜法很難分離的異構體，可以採用以矽膠為固定相的正相色譜分離分析；②根據被分離樣品極性差別進行族類分離；③易於水解樣品的分離分析；④分離分析高脂溶性樣品，其在極性有機溶劑中溶解度很小；⑤正相色譜也可以用於異構體分離(包括幾何異構體和光學異構體)。表8—13列出了正相色譜的主要特徵[8l。表8一13正相色譜的主要特徵
原理
正相色譜是採用極性固定相(如帶有二醇基、氨基、和氰基的固定相及矽膠、三氧化二鋁等)、非極性流動相(如正己烷等)的分離方法。這是一種根據分子的極性大小將其分開的液相色譜技術，因為正相色譜以吸附效應作為分離的基礎，所以也稱為吸附色譜。在正相色譜中，樣品分子與載體基質的矽醇基團發生特異的極性相互作用，與固定相產生強極性相互作用的極性樣品分子比較難被洗脫，在柱內停留比較長的時間，反之，極性較弱或非極性分子與矽膠之間產生相對較弱的相互作用，比較容易被洗脫，因而在柱內停留的時間較短。因此，正相色譜可以根據溶劑極性差別而達到分離的目的。
正相色譜的保留機理類似於吸附過程。極性樣品分子和溶劑分子吸附在柱填料表面的極性基團(吸附劑)上。對於正相中經常選用的氰基、氨基或二醇基固定相柱，吸附位點通常為鍵合相配體或矽烷醇。在使用矽膠時，吸附位點為矽烷醇(一SiOH)。極性樣品分子一般包含連線在烴基(如苯基或己基)上的一種或多種極性官能團。非極性樣品在吸附位點上的吸附力非常弱；但對於一些強極性化合物，也會由於其與固定相的相互作用非常強烈而導致分離效率較差，使得峰形嚴重拖尾。
種類與性質
優良的正相色譜填料，應當具有以下基本特性：
①表面具有極性活性基團即吸附位點；
②具有適宜形狀，最好呈微米級微球形，且粒徑分布均勻；
③具多孔性並有高比表面積，以承載較大的樣品負荷；
④在操作條件下化學性質穩定；
⑤具有高機械強度；
⑥價格合理且可穩定供應。
矽膠
在吸附色譜中最常用的填料是矽膠，此外氧化鋁和極性鍵合相矽膠亦是重要的正相填料。Al2O3，對於不飽和化合物，特別是芳香族化合物多核芳烴，保留能力較強，芳烴異構體可以得到良好分離；此外當樣品為鹼性化合物時，若使用矽膠則會造成嚴重吸附，溶質峰拖尾或難以洗脫，此時宜選用Al2O3進行分離。
矽膠的吸附選擇性可以表現為多種形式，如分子量或分子尺寸選擇性、功能團選擇性、形狀選擇性、異構體選擇性以及生化選擇性等，影響吸附劑選擇性的參數有：比表面積、平均孔徑和表面活性。
表面活性是正相色譜中作為填料的矽膠的一個重要參數，它主要依賴於表面矽羥基的類型、分布及其反應性。完全羥基化的表面具有最大的反應性，表面吸附的水或其他極性化合物，即使是極少量也會明顯地降低表面活性。此外，比表面積相對較低的大孔矽膠，其表面矽羥基的分布一般較為均一。這是因為，在它們的製造過程中，通過熱處理或燒結已使其無定形表面部分地具有能晶形的特徵。微孔矽膠的表面不確定性較高，故其表面活性比大孔矽膠要高。
極性鍵合相填料
極性鍵合相系以矽膠為基質，表面鍵合以極性基團，如一NH基、一CN基、一CH(OH)一CH2OH基以及一N02基等而製成的填料，分別稱為氨基、氰基、二醇基及硝基鍵合相填料，但其配基濃度一般較反相為低。依據表面修飾試劑和反應條件的不同，表面修飾層的濃度約在2～4 mol/m2。
極性鍵合相的配基比較複雜，因此在不同的流動相中會顯示出不同的特性。在非極性溶劑中，極性基團(如一NH2和一NH一等)主導與溶質的相互作用；而在極性溶劑中，配基的非極性鏈段的作用增強。當在水溶液體系中工作時，配基中的氨基在pH<7時會質子化，而殘餘矽羥基的去質子化起始於pH>7。因此與矽膠相比，上述極性化學鍵合相填料屬於中等極性填料。此外，由於有機配基對於矽膠表面的修飾，掩蔽了具有極高活性的矽羥基，使得極性化學鍵合相填料的穩定性和重現性有了較高的提高。
由於極性基團的種類繁多，故可以通過改變極性基團的方法控制分離的選擇性，因此具有更大的靈活性。極性鍵合相的極性通常弱於矽膠，所以更適於對中等極性物質的分離，其色譜條件選擇的方便性和重複性均優於矽膠。在極性鍵合相色譜填料中，研究較多的是氨基鍵合相填料。它的吸附過程與Si02相似但又有所不同。由於氨基的極性比矽羥基弱，且氨基位於烷基鏈末端，有一定的自由度(這與Si02及～20，不同)，加之氨基濃度亦較矽羥基濃度小，僅為2 mol/m2左右，故同一溶質於相同條件下在氨基柱上的保留要小一些，在分離酸性化合物，如酚、羧酸、核苷酸時較為有用。此外，氨基鍵合相填料對某些物質的特定基團會表現出優異的選擇性。例如，可以用乙腈一水為洗脫劑在氨基鍵合相柱子上分離單糖。氰基柱對幾何異構體或含雙鍵數目不同的化合物(環狀化合物)具有較好的分離能力。二醇基填料具有良好的生物相容性，更適於生化體系的分離。例如，多數以矽膠為基質的凝膠過濾介質，均採用了二醇基填料。硝基填料則對芳香族化合物有較好的選擇性。此外，短鏈配基的反相填料有時也可用作正相之用，例如，可用於油溶性維生素的分離分析，具有很好的重現性。
色譜柱
全多孔型的微球型或無定型矽膠，均可作為正相填料使用。但若用於高效分離，還是以球形矽膠為好，以其填裝的正相柱的滲透性較好，操作壓力較低，且柱子的穩定性也比較好。
參數
比表面積和表面活性
在正相色譜中，控制保留和選擇性的決定性參數是比表面積和表面活性，通過對這兩個參數的調節，可以調節一些分子的吸附一脫吸行為，從而達到分離的目的。對於矽膠，可以通過兩種方式降低其比表面積和表面活性。一種途徑是熱處理，當溫度高於200℃時，其表面矽羥基會通過脫水而使表面活性降低；而在溫度高於600℃時，通過燒結可導致比表面積的減小。另一種途徑則是調整吸附劑的含水量，以改變其表面活性和有效比表面積。通常，比表面積為200～400m2/g、平均孔徑為6～10mm的多孔矽膠是最常用的正相色譜填料。
表面活性是正相色譜中作為填料的矽膠的另一個重要參數，它主要依賴於表面矽羥基的類型、分布及其反應性。完全羥基化的表面具有最大的反應性，表面吸附的水或其他極性化合物，即使是極少量也會明顯地降低表面活性。此外，比表面積相對較低的大孔矽膠，其表面矽羥基的分布一般較為均一。這是因為，在它們的製造過程中，通過熱處理或燒結已使其無定形表面部分地具有微晶形的特徵。微孔矽膠的表面不確定性較高，故其表面活性比大孔矽膠要高。
樣品在矽膠上的負載量及線性容量
在所謂線性洗脫吸附色譜中，分離是在低樣品濃度下進行的。此時，吸附等溫線是線性的。高樣品濃度將會導致吸附等溫線偏離線性，成為凸形或凹形吸附等溫線。填料的線性吸附容量，可以定義為在每克吸附劑上引起等溫線線性部分分配係數值產生相對10%變化時的樣品量。對於給定的溶質和溶劑，線性容量主要決定於矽膠的比表面積及其表面活性。
矽膠的吸附選擇性
矽膠的吸附選擇性可以表現為多種形式，如分子量或分子尺寸選擇性、功能團選擇性、形狀選擇性、異構體選擇性以及生化選擇性等，LSC提供了對功能團和異構體選擇性分離的極好潛力。影響吸附劑選擇性的參數有：比表面積、平均孔徑和表面活性。
