植物負鏈RNA彈狀病毒侵染性cDNA克隆構建及反向遺傳學分析

《植物負鏈RNA彈狀病毒侵染性cDNA克隆構建及反向遺傳學分析》是依託浙江大學，由李正和擔任項目負責人的面上項目。

基本介紹

• 中文名：植物負鏈RNA彈狀病毒侵染性cDNA克隆構建及反向遺傳學分析
• 依託單位：浙江大學
• 項目負責人：李正和
• 項目類別：面上項目

項目摘要

以侵染性克隆技術為核心的反向遺傳學分析是現代分子病毒學研究中最基本、最重要的技術手段，然而迄今為止，國際上尚未有植物負鏈RNA病毒侵染性cDNA克隆成功構建的報導，這嚴重製約了該類病毒的基礎和套用研究。申請者實驗室在前期工作中，以彈狀病毒科苦苣菜黃網病毒（SYNV）為模式，建立了高效的SYNV微型複製子（minireplicon）反向遺傳學體系，為全長侵染性克隆構建打下了堅實的基礎。本項目擬在此基礎上，進一步最佳化微型複製子工作效率，並依次構建微型基因組（minigenome）和全長cDNA克隆，逐步解決影響克隆侵染性的技術難點，如啟動子利用、末端序列的忠實性和病毒組份多，模板長伴隨的低效問題，最終獲得SYNV侵染性cDNA克隆，並建立反向遺傳學技術體系。本項目的實施可望突破破制約植物負鏈RNA病毒研究的主要技術障礙，推動其它重要作物負鏈病毒的反向遺傳學研究，具有重要的理論意義和套用價值。

結題摘要

病毒侵染性克隆技術使對病毒基因組進行遺傳操作成為可能，是現代分子病毒學研究中最基本、最重要的技術手段。在本課題開展之前，國際上尚未有植物負鏈RNA病毒侵染性cDNA克隆成功構建的報導，嚴重製約了該類病毒的基礎和套用研究。申請者實驗室以彈狀病毒科苦苣菜黃網病毒（SYNV）為模式，在項目前期建立的SYNV微型複製子（minireplicon）反向遺傳學體系基礎上，通過最佳化微型複製子工作效率，逐步解決制約侵染性克隆構建的技術難點，最終獲得SYNV侵染性cDNA克隆，並建立反向遺傳學技術體系；構建了基於酵母同源重組的克隆體系，將SYNV拯救所需的質粒數目從7個減少到3個，提高了侵染效率，為複雜RNA病毒的侵染性克隆構建提供了新的技術手段；在SYNV侵染性克隆的基礎上，構建GFP等外源基因表達載體，利用反向遺傳學手段研究了病毒胞間運動和病毒粒子形態建成的機理；證明SYNV sc4蛋白為病毒編碼的運動蛋白，而最小的運動單元為核衣殼（nucleocapsid）；明確了病毒基質蛋白（M）和糖蛋白（G）為病毒粒子形態建成所必需，核膜定位的G蛋白通過其C端尾巴招募M蛋白，誘導核內膜內陷，為病毒粒子出芽提供場所。本研究首次成功構建了植物負鏈RNA病毒反向遺傳學體系，為該類病毒遺傳學研究掃出來技術障礙，同時也為植物彈狀病毒分子生物學研究和病毒載體開發掀開了新的篇章。