木爾坦棉花曲葉病毒C4蛋白抑制轉錄基因沉默的機理研究

《木爾坦棉花曲葉病毒C4蛋白抑制轉錄基因沉默的機理研究》是依託清華大學，由李煥改擔任項目負責人的青年科學基金項目。

基本介紹

• 中文名：木爾坦棉花曲葉病毒C4蛋白抑制轉錄基因沉默的機理研究
• 依託單位：清華大學
• 項目負責人：李煥改
• 項目類別：青年科學基金項目

項目摘要

木爾坦棉花曲葉病毒（CLCuMuV）是嚴重威脅棉花生產的雙生病毒，其編碼的C4蛋白涉及到病毒的運動，轉錄水平基因沉默（TGS），轉錄後基因沉默（PTGS）的抑制以及干擾宿主植物細胞周期從而產生嚴重的類似病毒病害的症狀，但其致病分子機制尚未清楚。為了揭示C4 蛋白在木爾坦棉花曲葉病毒(CLCuMuV)的入侵，運動及症狀形成中的作用，我們將C4蛋白作為誘餌，質譜分析和免疫親和純化技術結合利用篩選到與DNA甲基化循環相關的關鍵蛋白SAMS。通過酵母雙雜交和GST Pull-down實驗驗證了SAMS與C4蛋白的體外互作，並通過免疫共沉澱（Co-IP）和雙分子螢光互補實驗（BiFC）驗證了其體內互作。因此，本研究將圍繞CLCuMuV C4如何通過與SAMS的互作影響DNA甲基化途徑來抑制宿主細胞對病毒基因的沉默展開研究，以期明確C4在CLCuMuV侵染中的致病機理。

結題摘要

宿主DNA甲基化是植物抗DNA病毒的天然防禦反應。為了建立有效侵染，雙生病毒（Geminivirus）通過編碼特定蛋白來抑制植物對病毒DNA的沉默。本研究以木爾坦棉花曲葉病毒（CLCuMuV）為研究對象，分析雙生病毒抵禦植物轉錄水平基因沉默（Transcriptional gene silencing，TGS）的分子機制。 利用16-TGS轉基因植物系統對CLCuMuV及其衛星DNA（CLCuMuB）的TGS抑制活性進行檢測，結果顯示，CLCuMuV和CLCuMuB均有TGS抑制活性。進一步研究表明，CLCuMuV致病複合體編碼的C1、C2、C4及βC1 蛋白具有TGS抑制活性。通過亞硫酸氫鹽測序技術證明，CLCuMuV致病複合體和上述病毒蛋白都以不同的程度抑制植物外源基因的啟動子區域（35S啟動子）及內源轉座子（NbTnt1）的甲基化。 通過串聯親和純化和質譜連用以及體內和體外實驗鑑定CLCuMuV C4蛋白與植物甲基循環中的核心酶—S-腺苷甲硫氨酸合酶（SAMS）相互作用並抑制其酶活性。C4蛋白第13位精氨酸的突變（C4R13A）能夠消失C4與SAMS相互作用並抑制SAMS酶活性的功能。進一步實驗證明，C4蛋白的過量表達能夠恢復轉錄水平沉默的GFP基因表達，並降低外源（35S啟動子）和內源（NbTnt1）基因甲基化水平，而C4R13A則喪失了恢復TGS或降低甲基化水平的功能。C4R13A的病毒突變體（CLCuMuV-C4R13A）侵染植物後症狀減輕、病毒DNA的積累減少，而其IR區的甲基化水平則明顯增高。 NbSAMS基因的沉默能夠抑制16-TGS植株中GFP基因的表達，同時也會增加植物對雙生病毒的敏感性，並降低了CLCuMuV IR區的甲基化水平。 以上實驗結果表明，CLCuMuV誘導植物甲基化介導的TGS途徑並能成為它的靶標。CLCuMuV的C4蛋白通過與NbSAMS特異結合抑制SAMS活性，進而抑制NbSAMS介導的TGS，從而幫助病毒更有效的侵染宿主。 本研究揭示了C4抑制TGS的分子機制以及在病毒侵染過程中的重要作用。