《智慧型調控肺炎克雷伯氏菌甘油代謝的群體感應工程》是依託北京化工大學，由田平芳擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：智慧型調控肺炎克雷伯氏菌甘油代謝的群體感應工程
- 依託單位：北京化工大學
- 項目類別：面上項目
- 項目負責人：田平芳
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
以往的微生物育種局限於單細胞的基因改造，忽略了細胞間互作對目標產物的影響，導致實際生產產量低於實驗室產量，本研究在種群水平上進行育種。3-羥基丙酸(3-HP)是重要平台化合物，產自肺炎克雷伯氏菌的甘油還原途徑。首先考察甘油濃度、信號分子AI-2對生物量和3-HP產量的影響；重構其Ⅱ型群體感應（QS）網路，使之依照預定的邏輯程式智慧型合成3-HP，簡化發酵控制並弱化發酵後期的反饋抑制，從而提高3-HP產量；分析工程菌的代謝流向變化及發酵動力學，結合數學模擬，解析AI-2、生物量和3-羥基丙酸這三者之間內在聯繫這一關鍵科學問題。通過關鍵酶活性分析、差異表達基因分離以及KEGG途徑定位，解析QS調控甘油代謝的分子機理。該方案將QS用於工業育種，實現3-HP的智慧型合成和發酵過程簡化，為微生物代謝工程的新思路，不僅獲得高產菌和新型自動表達系統，而且為其它工業菌種的基因改造和發酵控制奠定理論和技術基礎。
結題摘要
肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae) 是近年工業微生物研究熱點。為動態調控甘油代謝，本研究重構該菌的群體感應（QS）。克隆了QS信號分子AI-2的合成酶基因ygaG，用pET-pk載體過表達該基因，獲得重組菌K. pneumoniae(pET-ygaG)；敲除該基因獲得ygaG缺失突變株K. pneumoniaeΔygaG。SDS-PAGE分析顯示該突變株在28 kDa和35 kDa左右出現差異條帶，MALDI-TOF-TOF質譜和螢光定量PCR顯示ygaG基因缺失導致膜蛋白和代謝相關基因的上調或下調。搖瓶發酵顯示，過表達ygaG抑制K. pneumoniae生長，而敲除ygaG基因則促進生長。掃描電鏡觀察發現，與野生型相比突變株細胞被膜表面更光滑，褶皺更淺。藥敏試驗表明突變株抗藥性增強。上述表明ygaG基因影響細胞被膜合成和致病性。為了動態調控乳酸代謝，構建4個QS工程菌，其一僅超表達信號分子醯基高絲氨酸內酯（AHL）的合成基因，另一菌同時表達AHL合成基因和其降解基因AiiA。相比於前者，後者對數生長期推遲。當表達乳酸脫氫酶ldhA時，與對照菌相比，前者的生長速度、生物量和甘油消耗速率分別提高了83.6%, 31.0% 和 36.0%, 而後者因動態協調細胞生長和乳酸積累而產生較多乳酸，D-乳酸產量和時空產率分別提高了231.9% 和117.3%。將QS元件和放大器耦合，構建了pBD-PhrpL-luxI-luxR-ParaC-hrpV和pcmR-15A-PluxI-hrpR- hrpS-PluxI-eGFP雙質粒菌密度開關。首次證明CRISPR/Cas9系統在肺炎克雷伯氏菌中具有切割雙鏈DNA功能。利用CRISPRi分別抑制該菌乳酸合成相關基因pmd、ldhA、aldA和mgsA, 或同時抑制這4個基因。發現ldhA為產乳酸關鍵基因。單獨或同時抑制4基因都能抑制乳酸合成。通過同源重組敲除影響3-HP合成的8個副產物基因。將可特異性識別DNA序列的LacI與cAMP受體蛋白(CRP)融合表達，將操縱區lacO插入啟動子上游，由融合蛋白引導CRP至目的基因。以此策略構建的雙質粒工程菌在5 L發酵罐中3-HP產量較野生菌株提高523%。採用複合啟動子和氮源補充策略3-HP發酵產量達到99 g/L，是目前報導的最高產量。
