《數字核酸等溫擴增集成流路晶片的研製》是依託浙江大學，由牟穎擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：數字核酸等溫擴增集成流路晶片的研製
- 依託單位：浙江大學
- 項目負責人：牟穎
- 項目類別：面上項目
- 批准號：31070772
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
擬採用國際先進的數字PCR技術結合新穎的環介導等溫擴增(LAMP,loop-mediated isothermal amplification)技術，研製集核酸提取、核酸等溫擴增及精確定量檢測為一體的數字多功能集成晶片系統，建立基於微流控晶片的數字核酸等溫擴增（Digital-LAMP）新方法。可以直接計數核酸初始拷貝數，實現核酸絕對定量，優於常規螢光定量PCR方法。數字等溫擴增集成晶片技術可以在等溫條件下擴增單一拷貝的核酸，識別單鹼基差異，具有特異性高、擴增速度快、交叉污染小、靈敏度高、試劑消耗少等優點。將本方法用於DNA或RNA研究，探索集成晶片上核酸等溫擴增的反應動力學規律，有望在半小時甚至更短的時間內實現病原體的定性和精確定量檢測及腫瘤分子遺傳分析，解決目前病原體鑑定及耐藥性分析時間過長的問題，同時，也為腫瘤早期分子診斷及個體化用藥提供依據。
結題摘要
本項目首先成功研製了集核酸提取、純化、等溫擴增及檢測為一體的多功能集成晶片系統，建立了基於微流控晶片的核酸等溫擴增方法，實現了等溫高效、特異性高的環介導等溫擴增(LAMP)反應，成功用於血液和癌細胞DNA的提取、純化及擴增檢測。DNA吸附在玻璃固相萃取柱表面，隨後直接被洗脫至下游的LAMP反應區，反應結束後通過反應室內螢光強度的改變情況判斷擴增與否，有效地實現“樣品進-結果出”的目標。全部過程在2小時內完成。這種一體化晶片具有特異性高、擴增速度快、交叉污染小、靈敏度高、試劑消耗少等優點，適於推廣套用。 數字核酸擴增技術通過單分子擴增檢測實現核酸絕對定量的強大功能。本項目研製了具有自主智慧財產權的無閥門、無動力、自吸式數字核酸等溫擴增集成流路晶片，建立了基於該晶片的單分子核酸擴增檢測方法，實現了數字LAMP反應，可直接計數核酸初始拷貝數，實現核酸絕對定量，定量的準確度優於常規螢光定量PCR方法。所發明的自吸式數字核酸等溫擴增集成流路晶片進樣十分簡便，就像真空採血管一樣吸入試液。套用時無需外接動力源、無微閥，使數字核酸擴增晶片從操控晶片各個功能單元的儀器中獨立出來，解決了晶片與外部系統的連線問題，消除了對儀器的依賴。這種自吸式晶片數字LAMP晶片具有數字PCR和核酸等溫擴增方法兩者的共同優點，可以在等溫條件下擴增單一拷貝的核酸，識別單鹼基差異，具有特異性高、擴增速度快、交叉污染小、靈敏度高、試劑消耗少等優點。 數字PCR的檢測優勢包括靈敏度、準確度、檢測動態範圍等都是隨著分配的小室數量的增多而提高的，同時通量的提高、反應體積的減少會極大提高單分子擴增的效率和減少污染，高通量、低成本。本項目還研製了156萬反應室/cm2的超高密度數字LAMP晶片，每個反應小室的體積僅僅160飛升，檢測能力達到7個數量級，準確度達到了99%，該晶片的檢測能力大大超過了現有的數字PCR 晶片，具有超高通量、低消耗、微型化、集成化和超大規模平行處理等方面的優勢。通過對B肝病毒HBV-DNA的數字LAMP檢測，驗證百萬超高密度飛升級數字LAMP反應的可行性。該系統具有超高通量、低消耗、微型化、集成化和超大規模平行處理等方面的優勢。數字等溫擴增晶片的操作簡單化、自動化、低廉化，有利於該晶片產品的產業化，該晶片為數字核酸擴增檢測儀器國產化奠定良好的基礎，為生命科學提供一種核酸絕對定量檢測的新工具。
