《抗凝血酶Leu99胺基酸位點突變對其功能影響的研究》是依託上海交通大學，由郁婷婷擔任項目負責人的青年科學基金項目。
基本介紹
- 中文名：抗凝血酶Leu99胺基酸位點突變對其功能影響的研究
- 項目類別：青年科學基金項目
- 項目負責人：郁婷婷
- 依託單位：上海交通大學
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
遺傳性抗凝血酶（AT）缺陷症是由編碼AT蛋白的基因突變所引起的，是靜脈血栓栓塞症的主要遺傳性危險因素。Leu99是導致AT缺陷症的突變熱點，已在多個家系中有報導，但突變導致疾病的分子發病機制目前仍未知。本項目在前期突變AT蛋白體外表達試驗的基礎上，擬通過純化AT Leu99Phe突變蛋白，進行一系列功能檢測試驗（包括與肝素結合試驗、抑制凝血因子IIa、Xa等活性）和結構檢測試驗（圓二色性檢測二級結構變化和熱穩定性），闡明Leu99Phe突變AT蛋白功能與結構的變化。同時通過對Leu99Ala（丙氨酸置換）、Leu99Ile（同源胺基酸置換）和Leu99Ser（極性胺基酸置換）突變體的研究，進一步闡明Leu99在AT蛋白中的重要作用。通過此項研究，將進一步了解AT作用的分子機制及其功能的結構基礎，並對以結構為基礎的抗血栓藥物的研發具有重要意義。
結題摘要
遺傳性抗凝血酶（Antithrombin, AT）缺陷症是由編碼AT蛋白的基因突變所引起的，是靜脈血栓栓塞症的主要遺傳性危險因素。Leu99（以下簡稱L99）是導致AT缺陷症的突變熱點，已在多個家系中有報導，本項目對AT L99胺基酸位點突變導致遺傳性AT缺陷症的分子機制進行了研究。通過果蠅細胞表達系統及AKTA蛋白分離純化系統，我們表達純化了野生型AT以及L99V、L99A、L99I和L99S等突變型AT蛋白，考馬斯亮藍染色及免疫印跡法顯示各突變AT蛋白與野生型AT蛋白大小一致，未見明顯雜帶。通過肝素結合實驗，我們檢測了重組AT蛋白與低分子量肝素鈉的結合能力，結果顯示AT L99V、L99A、L99I和L99S突變蛋白與低分子量肝素鈉的結合分別為相同濃度野生型AT蛋白的（44.8±3.6）%、（118.9±14.0）%、（15.2±8.8）%和（23.0±8.2）%。通過表面等離子共振技術（Surface plasmon resonance，SPR），我們檢測了重組AT蛋白與凝血酶（FIIa）及活化凝血因子X（FXa）的結合能力，結果顯示AT L99V、L99A、L99I和L99S突變蛋白與FIIa的結合分別為相同濃度野生型AT蛋白的13%、57%、3%和29%；AT L99V、L99A、L99I和L99S突變蛋白與FXa的結合分別為相同濃度野生型AT蛋白的7%、51%、1%和25%。將野生型及各突變型AT蛋白的濃度調整至正常AT血漿濃度後，通過發色底物法，我們檢測了重組AT蛋白的活性，結果顯示野生型AT蛋白及L99V、L99A、L99I、L99S等突變型AT蛋白活性分別為146.5%、21.4%、120.9%、10.8%和39.0%。圓二色性檢測顯示，AT L99突變後，二級結構發生變化，其中α-螺旋結構較野生型AT有所減少，而β-摺疊結構較野生型AT有所增加。本項目已完成既定研究內容，證實L99位點突變改變了AT的二級結構，破壞了AT與肝素、FIIa及FXa的結合，L99突變使AT蛋白活性下降，從而導致遺傳性AT缺陷症。
