《抑癌基因ZHX2調控肝癌細胞中DNMT3B表達的分子機制研究》是依託山東大學，由何影擔任項目負責人的青年科學基金項目。
基本介紹
- 中文名：抑癌基因ZHX2調控肝癌細胞中DNMT3B表達的分子機制研究
- 項目類別：青年科學基金項目
- 項目負責人：何影
- 依託單位：山東大學
中文摘要,結題摘要,
中文摘要
ZHX2是一個具有鋅指結構和同源框的轉錄抑制因子，具有抑癌基因活性。過表達ZHX2的肝癌細胞基因晶片和ChIP-on-chip結果提示：ZHX2能夠調控表觀修飾基因DNMT3B的轉錄表達。DNMT3B在多種惡性腫瘤，包括肝細胞肝癌（HCC）中異常高表達。目前已開發出針對DNA甲基轉移酶（DNMT）的化療藥物用於血液腫瘤疾病的臨床治療，但這些化學藥物對於包括HCC在內的實體瘤的治療效果有限。本課題在前期結果的基礎上，首先通過瞬時轉染技術在肝癌細胞模型中進一步明確ZHX2對DNMT3B的表達調控作用。進而研究ZHX2抑制DNMT3B表達後是否影響腫瘤抑制基因啟動子區域的甲基化水平。最後從尋找順式作用元件和探討ZHX2的反式作用功能域兩個角度深入探討肝癌細胞中ZHX2調控DNMT3B表達的分子機制，為開發針對DNMT的生物製劑用於HCC的臨床治療提供理論依據。
結題摘要
ZHX2是一個具有鋅指結構的同源框的轉錄抑制因子，具有抑癌基因活性。細胞表觀遺傳調控機制的紊亂在腫瘤的發生和發展中起到關鍵作用，包括DNA異常甲基化。目前已開發出針對DNA甲基轉移酶（DNMTs）的化療藥物用於血液腫瘤疾病的臨床治療，但這些化學藥物對保護HCC在內的實體瘤的治療效果有限。本研究利用肝癌細胞系遺傳操作ZHX2，證實過表達或干擾ZHX2能夠下調或上調DNMT3B蛋白和mRNA表達水平，並且在臨床肝癌組織中免疫組化檢測DNMT3B和ZHX2的表達狀況，結果顯示DNMT3B在肝癌組織中的表達強度顯著高於癌旁組織中，跟腫瘤組織大小和腫瘤TNM分期沒有明顯相關性，但與腫瘤組織中ZHX2的表達負相關。為了探討ZHX2調控DNMT3B表達的分子機制，我們克隆得到DNMT3B啟動子片段（-1028～+198）和短片段（-400～+50），利用雙螢光素酶基因報告系統證實ZHX2過表達均能抑制其活性。ChIP-PCR也證實ZHX2與DNMT3B啟動子區域結合。對免疫沉澱下來的蛋白進行質譜分析，初步確定蛋白ASAP2和POTEE可能參與ZHX2轉錄抑制複合物組成。從而明確ZHX2蛋白結合到DNMT3B啟動子區抑制其轉錄表達，暗示ZHX2可以用於靶向DNMT3B的基因治療。然而ZHX2編碼區全長為2314bp，直接操作ZHX2基因全長實現基因的高效、靶向性表達是非常困難的。因此本課題通過構建ZHX2蛋白基序片段，結合雙螢光素酶啟動子活性檢測系統，確定ZHX2(242～338aa-NLS)和ZHX2(339～446aa)片段能夠分別高效抑制DNMT3B表達，更具有用於靶向DNMTs的基因治療的開發潛能。對肝癌細胞基因組上5-mC的檢測結果顯示，過表達ZHX2並不能影響總體5-mC水平。RRBS對肝癌細胞基因組內啟動子及CpG島區域的甲基化狀況進行分析，結果顯示與5-mC檢測結果一致，ZHX2過表達組與對照組中C位點的甲基化水平相近；mCG、mCHG和mCHH三種鹼基類型是mC的主要組成部分，兩組中mCG均是主要的甲基化胞嘧啶類型；共發現130個差異性甲基化區域（DMR），這130個DMR共指向75個基因。綜上，課題實施明確了ZHX2對DNMT3B基因表達的負調控作用，並初步揭示了ZHX2轉錄抑制作用機制，為開發針對DNA甲基轉移酶的生物製劑用於HCC的個體化臨床治療提供新思路。
