是指直徑在60-250μm，能適用於貼壁細胞生長的微珠。一般是由天然葡聚糖或者各種合成的聚合物組成。
基本介紹
- 中文名：微細胞
- 組成成分：天然葡聚糖或者各種合成的聚合物
- 直徑：60-250μm
- 適用範圍：適用於貼壁細胞生長的微珠
基本介紹,原理與操作,三個方面,分類系統,培養優點,
基本介紹
自Van Wezel用DEAE-Sephadex A 50 研製的第一種微載體問世以來，國際市場上出售的微載體商品的類型已經達十幾種以上，包括液體微載體、大孔明膠微載體、聚苯乙烯微載體、PHEMA微載體、甲殼質微載體、聚氨酯泡沫微載體、藻酸鹽凝膠微載體以及磁性微載體等。常用商品化微載體有三種：Cytodex1、2、3，Cytopore和Cytoline。
●微載體的大小：增大單位體積內表面積（S/F）對細胞的生長非常有利。使微載體直徑儘可能小，最好控制在100-200μm之間。
●微載體的密度：一般為1.03-1.05g/mL，隨著細胞的貼附及生長，密度可逐漸增大。
●微載體的表面電荷：據研究，控制細胞貼壁的基本因素是電荷密度而不是電荷性質。若電荷密度太低，細胞貼附不充分，但電荷密度過大，反而會產生“毒性”效應。
原理與操作
1.原理：其原理是將對細胞無害的顆粒-微載體加入到培養容器的培養液中，作為載體，使細胞在微載體表面附著生長，同時通過持續攪動使微載體始終保持懸浮狀態。
貼壁依賴性細胞在微載體表面上的增殖，要經歷黏附貼壁、生長和擴展成單層三個階段。細胞只有貼附在固體基質表面才能增殖，故細胞在微載體表面的貼附是進一步鋪展和生長的關鍵。黏附主要是靠靜電引力和范德華力。細胞能否在微載體表面黏附，主要取決於細胞與微載體的接觸機率和相融性。
2. 攪拌轉速：由於動物細胞無細胞壁，對剪下力敏感，因而無法靠提高攪拌轉速來增加接觸機率。通常的操作方式是：在貼壁期採用低攪拌轉速，時攪時停；數小時後，待細胞附著於微載體表面時，維持設定的低轉速，進入培養階段。微載體培養的攪拌非常慢，最大速度75r/min。
3.細胞與微載體的相融性，是與微載體表面理化性質有關。一般細胞在進入生理PH值時，表面帶負電荷。若微載體帶正電荷，則利用靜電引力可加快細胞貼壁速度。若微載體帶負電荷，因靜電斥力使細胞難於黏附貼壁，但培養液中溶有或微載體表面吸附著二價陽離子作為媒介時，則帶負電荷的細胞也能貼附。
三個方面
●在細胞方面，如細胞群體、狀態和類型。
●在微載體方面，如微載體表面狀態、吸附的大分子和離子；微載體表面光滑時細胞擴展快，表面多孔則擴展慢。
●在培養環境中，如培養基組成、溫度、pH、DC以及代謝廢物等均明顯影響細胞在微載體上的生長。如果所處條件最優，則細胞生長快；反之生長速度慢。
5. 微載體培養操作要點
●培養初期：保證培養基與微球體處於穩定的PH與溫度水平，接種細胞（對數生長期，而非穩定期）至終體積1/3的培養液中，以增加細胞與微載體接觸的機會。不同的微載體所用濃度及接種細胞密度是不同的。常使用2-3g/L的微載體含量，更高的微載體濃度需要控制環境或經常換液。
●貼壁階段（3-8d）後，緩慢加入培養液至工作體積，並且增加攪拌速度保證完全均質混合。
●培養維持期：進行細胞計數（胞核計數）、葡萄糖測定及細胞形態鏡檢。隨意細胞增殖，微球變得越來越重，需增加攪拌速率。經過3d左右，培養液開始呈酸性，需換液：停止攪拌，讓微珠沉澱5min，棄掉適宜體積的培養液，緩慢加入新鮮培養液（37℃），重新開始攪拌。
●收穫細胞：首先排乾培養液，至少用緩衝液漂洗1遍，然後加入相應的酶，快速攪拌（75-125r/min）20-30min。然後解離收集細胞及其產品。
●微載體培養的放大：可以通過增加微載體的含量或培養體積進行放大。使用異倍體或原代細胞培養生產疫苗、干擾素，已被放大至4000L以上。
分類系統
生物反應器系統
此技術大規模培養，細胞擴增的效率受到諸多因素的影響和限制，其中主要的限制性因素包括：細胞對剪下力的敏感性、氧的傳遞以及傳代和擴大培養等。而研製的各種類型生物反應器系統則可針對上述限制性因素，為微載體細胞培養與擴增提供低剪下力、高氧傳遞效率、易於細胞傳代等適宜的外部環境。已較多使用的微載體培養系統生物反應器，可以實行計算機控制操作，培養攪拌速度及懸浮均勻程度、溫度變化、PH穩定及溶氧供應（O2、N2、CO2、空氣四種純化氣體按比例調節）、罐壓、培養體積和通氣量等參數全部由電腦自動控制。因此，套用生物反應器系統進行微載體細胞大規模擴增具有明顯優勢，目前國外相繼研製了數種適合進行微載體大規模細胞培養的生物反應器系統，如攪拌式生物反應器系統、旋轉式生物反應器系統以及灌注式生物反應器系統等。
攪拌式生物反應器系統
攪拌式生物反應器系統在微載體細胞大規模擴增研究領域已有較長的研究歷史，但因該細胞培養系統容易產生過大的剪下力，從而限制了其套用範圍。儘管如此，由於該系統具有簡單、實用及價格低廉等特點，國內外仍有不少套用該系統成功進行細胞大規模擴增的研究報導。例如，Werner A（2000年）成功地在該系統內進行了肝細胞大規模擴增的研究。
灌注式生物反應器系統
灌流培養是目前研究熱點之一。它的特點是不斷地加入新鮮培養基以及不斷地抽走含細胞代謝廢物的消耗培養基，使細胞得以在一個相對穩定的生長環境內增殖，即省時省力，又減少了細胞發生污染的機會，且可以提高細胞密度10倍以上。
旋轉生物反應器
近年來，旋轉生物反應器系統（RCCS）已經成為套用微載體技術進行細胞大規模擴增的一種較常用細胞培養系統。該系統是基於美國航空航天局為模擬空間微重力效應而設計的一種生物反應器。RCCS既可以用於微載體大規模細胞培養，又能在其內培育細胞與支架形成的三維空間複合體。至今，近百種組織細胞均在該系統內成功進行了大規模擴增。
培養優點
●表面積/體積（S/V）大，因此單位體積培養液的細胞產率高；
●把懸浮培養和貼壁培養融合在一起，兼有兩者的優點；
●可用簡單的顯微鏡觀察細胞在微珠表面的生長情況；
●簡化了細胞生長各種環境因素的檢測和控制，重現性好；
●培養基利用率較高；
●放大容易；
●細胞收穫過程不複雜；
●勞動強度小；
●培養系統占地面積和空間小。
