《微流控體系下DNA-蛋白質相互作用的單分子檢測技術研究》是依託復旦大學，由張松擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：微流控體系下DNA-蛋白質相互作用的單分子檢測技術研究
- 依託單位：復旦大學
- 項目類別：面上項目
- 項目負責人：張松
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
該研究目標是利用微流控技術和全內反射螢光顯微技術相結合，發展可用於細胞內蛋白複合物的相互作用、高通量、可視化的單分子檢測新方法。與傳統生物化學測量不同，單分子檢測可反映出單個蛋白分子的結構變化和動力學。研究首先擬發展微流控PDMS表面改性技術和雷射共聚焦螢光顯微法，系統研究螢光蛋白分子在微流控表面的吸附和固定效果。其次，通過微流控層流技術控制蛋白複合物分子在微晶片表面的濃度、結構和擴散係數等參數。最後，我們將這種微流控-單分子檢測技術套用於1、研究二種親和力強弱不同的適配子(15-和32-鹼基對)，與凝血酶相互作用的可視化及動力學差異，為解決瞬態、弱的蛋白相互作用研究提供一種可行的方法；2、在微反應室中固定Her2乳腺癌細胞，將蓖麻毒素A鏈蛋白與碳納米管結合，觀察細胞表面的吞噬作用和細胞內的代謝過程。這種微流控-單分子檢測技術在藥物靶向篩選、蛋白質相互作用等許多領域都有很好的套用。
結題摘要
活細胞內DNA與蛋白相互作用一直是化學及生物科學家研究的熱點。但是，即使是高通量的蛋白組學方法也難以解決低豐度、低濃度的蛋白質及其弱相互作用的檢測，假陽性和假陰性問題普遍存在。該項目的研究目標是利用微流控和雷射共聚焦螢光顯微等技術相結合，發展可用於細胞蛋白質與DNA的相互作用、高通量、可視化的單分子檢測新方法。我們的研究內容包括：1、建立了一種新型的微流控螢光分析平台，可用於腫瘤細胞的高通量和可視化檢測，為活細胞內的蛋白質功能研究提供了一種可靠的技術。這種33通道的PDMS微流控晶片的檢測原理基於氧化石墨烯與螢光核酸適體之間發生了螢光共振能量轉移效應，利用核酸適配體Sgc8能與CCRF-CEM細胞表面過表達的酪氨酸激酶（PTK7）發生專一作用，從而誘導FAM-Sgc8c/GO複合物的螢光信號恢復來定量檢測通道中腫瘤細胞的濃度，其檢測限達到了單細胞水平，有望套用於腫瘤細胞水平早期篩查和診斷。2、建立了活細胞原位螢光成像的新方法，可用於腫瘤活細胞膜表面膜蛋白和細胞核內蛋白質的可視化檢測。研究採用雷射共聚焦螢光顯微技術，發展了石墨烯-螢光單標記適配體複合探針、納米石墨烯-螢光單標記多肽複合探針、苯硼酸標記的納米螢光矽球複合探針等，實現了對多個和單個活細胞中膜蛋白、核蛋白和糖基化官能團等多目標、多層次地活體螢光成像分析，可用於腫瘤的早期診斷和治療研究。3、建立了多種高靈敏、非標記的光/電化學分析新方法，可檢測微量的目標細胞和蛋白質。如基於適配體構象變換和循環酶切放大原理，發展了一種高靈敏、簡便、可視化檢測腫瘤細胞的比色新方法，檢測限達到了48個細胞。該方法簡單、靈敏，非常適合於腫瘤細胞的早期診斷和篩選。發展了一種基於納米Fe3O4顆粒-核酸適配體的非標記電化學分析方法，電極表面凝血酶與核酸適體相互作用產生的構象變化，用高靈敏的示差脈衝伏安法檢測，檢測限可達100 pM的凝血酶，具有很好的臨床套用價值。總的來看，我們在微流控晶片與螢光顯微檢測接口技術、弱信號放大和可視化技術、活體螢光標記技術、非標記的納米感測技術方面形成了自己的特色，可套用於活細胞螢光成像、腫瘤早期篩查、診斷和治療等眾多領域。
