《從靈芝菌絲體中高效分離製備抗腫瘤靈芝酸單體的研究》是李英波撰寫的一篇論文。
基本介紹
- 中文名：從靈芝菌絲體中高效分離製備抗腫瘤靈芝酸單體的研究
- 分類號：TQ461
- 作者：李英波
- 論文來源：華東理工大學
- 發表日期：2013-04-09
論文摘要,引文格式,
論文摘要
靈芝酸是名貴藥用真菌—靈芝的主要活性成分之一,具有多種重要的藥理功能,其中以抗腫瘤作用尤其引起人們的興趣和重視。然而,隨著它的藥用價值被廣泛揭示的同時,大量高純度單體的獲取成為了阻礙其深入的藥理研究和廣泛套用的瓶頸。本實驗室發明的靈芝兩階段培養是一種高效生產靈芝酸的方法,但相應的高效製備技術及相關理論研究的缺乏依然制約著靈芝酸的深入開發。另外,靈芝酸的穩定性對其分析分離具有重要的影響,但至今只有本實驗室報導了7-乙氧基-靈芝酸-O的穩定性,尚未見有關其它靈芝酸的穩定性的報導。本學位論文採用兩階段培養的靈芝菌絲體為材料,分析了其主要靈芝酸的組成,考察了它們的穩定性。在此基礎上,開發了一種同時快速製備多種靈芝酸單體的方法,並進一步建立了具有高回收率和高純度製備靈芝酸T的低壓層析技術及其動力學模型。本學位論文首先採用矽膠柱層析、薄層層析和半製備高效液相色譜等分離方法,綜合運用紫外光譜、紅外光譜、質譜、和核磁共振等波譜技術,從靈芝菌絲中分離和鑑定了八個靈芝酸單體,包括I類靈芝酸：Mc, DH,7-乙氧基-靈芝酸O和II類靈芝酸：Mk,S,T,Mf和R。其中,靈芝酸DH為一個未見文獻報導的靈芝酸。隨後的穩定性實驗表明：Ⅰ類靈芝酸在非質子性溶劑中相對穩定,而質子性溶劑下,容易轉化相應的II類靈芝酸。II類靈芝酸由於具有穩定的共軛體系,電子云分布比較均勻,在兩類溶劑中均穩定。基於以上研究結果,以非質子性的乙腈取代質子性甲醇作為樣品溶媒,並建立了一種可以同時檢測以上兩類靈芝酸的反相高效液相光二極體陣列檢測法(RP-HPLC-PAD)。該方法使用C18反相色譜柱,以乙腈和水為流動相進行梯度洗脫。實驗結果表明,該方法線性關係好,精密度、準確度和回收率高,可以為靈芝酸的分離製備和代謝調控的研究提供可靠的分析平台。粗分離是單體活性物質製備的重要基礎。靈芝酸傳統的粗分離方法具有操作時間長,回收率低等缺點。本學位論文接著以具有良好抗癌活性靈芝酸Mk和T為模式分子,探索大孔吸附樹脂對靈芝酸粗分離的效果。通過靜態實驗篩選,從六種大孔樹脂中確定ADS-8樹脂為最佳的粗分離介質。動力學研究表明,準二級方程對吸附數據具有良好的擬合效果(R2>0.999)。通過熱力學研究發現,ADS-8樹脂對靈芝酸的吸附屬於物理吸附,低溫有利於吸附。最後,動態實驗確定ADS-8樹脂分離靈芝酸Mk和T的柱層析條件：上樣體積為7.3BV；吸附和洗脫流速均為4BV/h,洗脫程式為先用3BV55%的乙醇洗脫,再用6BV的80%的乙醇洗脫。經單次分離後,靈芝酸Mk和T的含量分別從4.5%和2.2%提高至34.1%和14.5%,回收率分別為90.1%和72.2%。以上結果表明,ADS-8大孔吸附樹脂對靈芝酸的粗分離具有回收率高、操作簡單和放大容易等特點,在靈芝酸的分離方面具有較大的套用潛力。在以上研究基礎上,建立一種同時提取和水解的方法用於快速製備四種II類靈芝酸單體(Mk, S, T和R)。該方法可以將四個Ⅰ類靈芝酸(Mc, HD,7-ethyl-O-GA-O和DH)分別轉化為相應的Ⅱ類靈芝酸(Mk,S,T和R),大大簡化了粗提物中靈芝酸的種類,降低了後續分離純化步驟的難度。經處理後,產物的得率提高200%-400%。由該方法獲得的粗提液無需任何處理,可直接進料至ADS-8大孔樹脂層析柱去除蛋白質、多糖等雜質。樹脂層析初分離的樣品經半製備液相純化,容易同時獲得純度大於97%的四種單體。該方法克服了靈芝酸的傳統分離工藝中不同操作單元之間的銜接性差,分離時間長和產物回收率低等缺陷。由於靈芝酸的製備均以費用較高的高效反相液相作為最後的純化手段,難以大規模生產。另外,相關的層析理論研究尚未報導。因此,本論文最後探索了低壓反相層析分離製備靈芝酸T的可行性。結果表明,以靈芝酸T含量為18.4%的粗提物為分離材料,在小柱(14×235mm)和大柱(42×273mm)上均實現了靈芝酸T的高效製備,其純度和回收率均大於90%；其中在大柱上,首次實現了克級靈芝酸T的單次製備,柱層析時間小於2小時。以上結果表明,低壓反相層析完全可以替代高效製備液相用於靈芝酸T的大規模生產。隨後,基於低壓反相層析相關實驗數據,建立靈芝酸T的層析動力學模型。經實驗驗證,模型計算圖譜與實驗圖譜吻合良好,表明該模型較好地反映了柱層析分離過程。對模型參數的進一步研究發現,所建立的模型對Biot準數不敏感,而Pe準數值僅在小於1000時,色譜峰的擴展對該參數具有較為敏感的回響。另外,顆粒曲折因子和εb對模型計算結果影響顯著。其中,εb不但容易改變色譜峰的保留,而且影響峰的擴展。所建立的模型不但為今後靈芝酸T分離過程的最佳化和放大提供理論指導,也為其它靈芝酸的分離純化提供良好的借鑑作用。綜上所述,本學位論文從靈芝菌絲中分離了八個主要的靈芝酸單體,考察了它們的穩定性,建立了它們的分析方法。在此基礎上,建立了靈芝酸單體的高效製備方法和相關的層析動力學模型,為靈芝酸進一步的藥物研究及臨床試驗提供了堅實的物質基礎。同時相關的研究方法和思路對其它活性天然產物的分離製備也有良好的借鑑作用。
引文格式
[1]李英波. 從靈芝菌絲體中高效分離製備抗腫瘤靈芝酸單體的研究[D].華東理工大學,2013.
