《建立人胚胎幹細胞神經定向分化過程中的譜系追蹤系統》是依託同濟大學，由章小清擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：建立人胚胎幹細胞神經定向分化過程中的譜系追蹤系統
- 項目類別：面上項目
- 項目負責人：章小清
- 依託單位：同濟大學
中文摘要,結題摘要,
中文摘要
理解發育過程中細胞譜系間的衍生規律是發育學的核心，也是靶向多能幹細胞分化為特定的細胞類型並套用於再生醫學的理論基礎。基於Cre/Loxp轉基因小鼠的譜系追蹤，由於其較好的結合了基因表達的時空特徵和便捷的報告體系，被廣泛套用於發育過程中細胞命運決定機制的研究並取得了令人矚目的成就。然而，對於人類細胞，針對不同譜系細胞的發育規律，我們卻缺乏有力的研究手段。本申請擬結合我們現有的人多能幹細胞體外培養和神經定向分化技術與新興的基於TALEN/Cas9的同源重組技術，體外構建針對人類早期發育過程的譜系追蹤系統。這包括建立AAVS1位點的CAG-Loxp-Stop-Loxp-eGFP同源重組人胚胎幹細胞系，和基於該細胞系的靶基因啟動子驅動的Cre重組細胞系。在靶基因的選擇上，聚焦神經發育，研究Pax6、Nkx2.1、Lhx6/8陽性神經上皮或前體細胞的譜系轉換，探討人早期神經發育過程中的基礎理論問題。
結題摘要
構建出可誘導的人胚胎幹細胞譜系示蹤系統。利用同源重組方法，在人多能幹細胞（hPSCs）特異的染色體開放位點AAVS1整合受重組酶Cre或Flp控制的轉錄終止調控元件片段LoxP-STOP-LoxP（LSL）或FRT-STOP-FRT（FSF），同時選取GFP作為報告基因，構成可控制的報告基因系統；在譜系特異性表達的調控開關方面，我們選取了人特異的早期神經外胚層（neuroectoderm，NE）轉錄因子PAX6和早期神經管底板（floor plate，FP）轉錄因子FOXA2作為驅動重組酶Cre或Flp表達的基因。通過2A連線重組酶替換PAX6和FOXA2終止密碼子，以及將重組酶替換PAX6和FOXA2起始密碼子，構建成PAX6和FOXA2的譜系特異性表達的GFP示蹤的譜系示蹤系統。此外，採用重組酶羧基末端連線突變雌激素受體片段（estrogen receptor，ER）的策略，構建出可誘導的重組酶入核的細胞系，提高譜系示蹤的靈活性與可控性。通過體外神經定向分化系統和體內畸胎瘤實驗，證明上述的多種方法可以成功用於譜系示蹤，為構建譜系示蹤人細胞系提供更靈活、精確的選擇。基於這一系統，我們證明了PAX6陽性的NE是人神經系統NP的起源，揭示了人腦發育的特有屬性。
