差異凝膠電泳技術( two-dimensional difference gel electrophoresis，2D-DIGE) 建立在雙向電泳技術的基礎上，能夠在同一塊雙向電泳膠中分離多於一種品。Jonathan 實驗室最先使用這項技術，後來被Amersham Biosciences 公司進一步的最佳化並市場化。由於差異凝膠電泳技術可在同一塊膠中進行兩個蛋白質樣品差異的檢測與定量，從而避免了傳統雙向電泳技術膠與膠之間重複性差的缺陷。
基本介紹
- 中文名：差異凝膠電泳
- 外文名：Difference Gel Electrophoresis
- 螢光染料：Cy2、Cy3 和Cy5
- 套用：糖尿病的檢查
- 優勢：樣品量小
- 反應：親核反應
原理,套用,醫學,植物、細菌,
原理
差異凝膠電泳是以在雙向電泳前先對蛋白樣品進行螢光標記為基礎的。螢光染料標記的方法分為兩種: 最小標記法和飽和標記法，其中最小標記法較為常用。對於最小標記法，3 種用來標記的螢光染料Cy2、Cy3 和Cy5 是來源於N-羥基琥珀醯亞胺的衍生物，結構相似，可與賴氨酸殘基側鏈的ε-氨基基團進行親核取代反應形成氨基化合物，所帶正電荷與賴氨酸殘基上被取代的電荷相匹配。3 種染料的分子量是相匹配的，使被標記蛋白增加大約0.5D。對最佳化的標記反應進行質譜分析，結果表明每個蛋白質分子被一個染料分子標記。
即使多個賴氨酸殘基被標記，雙標記所占的百分比很低，難以檢測，故只有1% － 3%的蛋白樣品被標記。最小標記法中染料與蛋白的最佳標記比例為每50 μg 蛋白樣品採用400 pmol 螢光染料進行標記。對於飽和標記法，用來標記的兩種螢光染料具有順丁烯二醯亞胺反應基團，可與蛋白中半胱氨酸殘基的硫醇基形成硫醚鍵，從而達到標記的目的。飽和標記法將對蛋白樣品中所有可用的半胱氨酸殘基進行標記，故需要大量的染料，被標記蛋白樣品的比例很高。兩種染料的分子量同樣是相匹配的，使被標記蛋白增加大約0. 677 kD。不論是最小標記法或是飽和標記法，都可確保被標記的同一蛋白質在雙向電泳膠中遷移到相同的位置。此種方法敏感度高，僅需5 μg 蛋白樣品，對於比較珍貴的實驗樣品( 人類的器官、組織等) 更具有優勢。
套用
差異凝膠電泳技術雖然市場化時間不長，但因其更高的敏感度及更精確的定量，而在醫學、植物、細菌、昆蟲等生物學領域的研究中套用。尤其是在與人類疾病相關的各種病變細胞與正常細胞蛋白質的比較方面的套用，為人類對致病潛在候選蛋白的鑑定、對臨床樣品的檢測及深入研發抗病變藥物等的研究提供了理論依據。
醫學
García-Ramírez 等將差異凝膠電泳技術及質譜技術相結合，對患有糖尿病視網膜病變的患者以及患有先天性黃斑裂孔的非糖尿病患者的玻璃狀液總蛋白進行研究。結果表明，患有糖尿病視網膜病變的患者其玻璃狀液中有11 種蛋白表達量發生了變化，其中8 種蛋白表達量上調，3種蛋白表達量下降。從這11 種蛋白中選取5 種，進行Western 雜交試驗，結果顯示這5 種蛋白表達量變化與差異凝膠電泳技術分析結果一致，進一步證實了差異凝膠電泳技術的精確定量能力，並對糖尿病視網膜病變致病機理中潛在的新候選蛋白的鑑定工作提供了有力幫助。
植物、細菌
植物在其生長周期中會遇到一系列生物和非生物脅迫。環境因素如強光、乾旱、高溫或低溫，以及鹽濃度都會影響植物的生長發育，導致作物減產。在這些不利因素的影響下，植物本身已形成一系列的防禦機制。
