《尿素通道蛋白 B 與小分子抑制劑結合位點的確定》是依託北京大學，由李敏擔任負責人的青年科學基金項目。
基本介紹
- 中文名：尿素通道蛋白 B 與小分子抑制劑結合位點的確定
- 項目負責人：李敏
- 依託單位：北京大學
- 項目類別：青年科學基金項目
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
尿素通道蛋白是特異性通透尿素的膜蛋白，在尿濃縮機制中發揮重要作用，可研發成為新的利尿藥作用靶點。本實驗室前期研究顯示UT-B抑制劑噻吩並喹啉類化合物具有較強的利尿作用，且不引起電解質及代謝紊亂，具有開發成新型利尿藥的潛力。我們前期工作套用計算機輔助藥物設計方法預測了UT-B與噻吩並喹啉等小分子抑制劑的結合位點和結合的關鍵胺基酸以及結合方式，並以定量構效關係分析、分子動力學模擬和跨物種結構分析驗證了這些抑制劑與UT-B作用的分子機制。本項目擬在此基礎上，利用定點突變技術和化合物藥效學評價，確認抑制劑在UT-B上的結合位點和結合的關鍵胺基酸；依據已確認的結合位點，利用計算機藥物虛擬篩選結合UT-B抑制劑紅細胞裂解篩選模型，篩選新的抑制劑，確認抑制劑構效關係及其與UT-B作用的關鍵化學基團，建立UT-B與其抑制劑的作用模型。本項目的目標是為研發尿素通道抑制劑類新型利尿藥提供理論依據和線索化合物。
結題摘要
尿素通道蛋白是特異性通透尿素的膜蛋白，在尿濃縮機制中發揮重要作用，本實驗室前期研究顯示UT-B抑制劑噻吩並喹啉類化合物具有較強的利尿作用，且不引起電解質及代謝紊亂，具有開發成新型利尿藥的潛力。 本項目利用實驗室前期發現的尿素通道抑制劑建立了計算機虛擬篩選模型，並且分析抑制劑和尿素通道B(UT-B)的作用機制。以此為基礎，篩選得到一類新的抑制劑Phenylphthalazines，體外具有UT-B抑制活性，並分析了該類活性最佳化合物PU1424與UT-B的作用方式。對已有抑制劑進行結構改造，獲得噻吩並吡啶類化合物SAZcb-20，對人、大鼠和小鼠IC50分別為0.23μM、0.47 μM和 2.00 μM。體內利尿實驗結果顯示大鼠單次和多次皮下注射SAZcb-20表現出不同程度的利尿作用；尿滲透壓及尿尿素濃度降低，且對血尿素、血糖、血脂均無顯著影響，尤其不影響電解質平衡。Transwell實驗證明SAZcb-20對UT-B和 UT-A1均有一定的抑制作用。但該類化合物口服未觀察到利尿作用。 於是，我們利用建立的計算機虛擬篩選和紅細胞尿素通道抑制劑篩選模型篩選出二芳基醯胺類化合物，有明顯的UT-B抑制作用，對人、大鼠和小鼠UT-B 抑制IC50分別為1.60、0.99和0.25μmol/L。體內實驗發現，灌胃給該類化合物後，小鼠尿量便增加，尿滲透壓顯著降低。連續灌胃給藥7 天，給藥組大鼠尿量相比對照組明顯增加，滲透壓明顯降低，利尿效果較為穩定。 為了確認抑制劑和UT-B的作用機制，我們利用計算機輔助藥物設計分析了二者的作用機制，預測了可能的作用位點，以此為依據建立了ASP280GLY、ASN289TRP、ALA337ARG三點同時突變慢病毒質粒。結果顯示三個點突變後UT-B抑制劑PU-48不能抑制其尿素轉運，說明PU-48與UT-B作用位點可能是ASN289TRP、ALA337ARG、ALA337ARG單個或二者或三者皆是。於是，建立了ASN289TRP、ALA337ARG和ASP280GLY單突變的UT-B MDCK細胞。結果顯示，PU-48仍能抑制ASN289TRP、ALA337ARG和ASP280GLY單突變的MDCK尿素轉運，說明尿素通道抑制劑不是單獨作用於一個胺基酸，可能共同作用於ASP280GLY、ASN289TRP和ALA337ARG或者不同組合。
