《尋找類胰島素肽6（INSL6）的受體》是依託同濟大學，由郭占雲擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：尋找類胰島素肽6(INSL6)的受體
- 項目類別：面上項目
- 項目負責人：郭占雲
- 依託單位：同濟大學
中文摘要,結題摘要,
中文摘要
類胰島素肽6（INSL6）是1999年才發現的一個與胰島素同源的多肽，主要在睪丸中表達，推測其可能與雄性生殖相關，但它的受體至今未找到，成為其功能研究的瓶頸。本申請擬在重組表達INSL6的基礎上，通過生物化學和生物信息學的方法確定INSL6的受體。（1）用放射性同位素標記的重組INSL6為探針，用動物組織器官的細胞膜提取物為受體來源，建立INSL6的受體結合測定體系，確定INSL6受體表達的組織器官特異性及其與INSL6結合的親和力及特異性。（2）通過配基親和層析等方法從高表達INSL6受體的動物組織器官中分離純化該受體，通過化學測序及質譜測序等方法獲得其部分胺基酸序列，然後通過序列同源比對從資料庫中找出可能的INSL6受體。（3）獲得候選INSL6受體的cDNA並在動物細胞中重組表達，再通過受體結合測定等方法確認INSL6受體。該項目可以為揭示INSL6在雄性生殖中的作用打下基礎。
結題摘要
類胰島素肽6（insulin-like peptide 6, 簡稱INSL6）是1999年克隆的一個胰島素超家族成員，主要由睪丸精母細胞表達，在精子生成過程中發揮作用。然而INSL6的受體還未找到，阻礙了對其生理功能的深入研究，因此我們希望通過本課題的研究能夠找到INSL6的受體。近3年來圍繞該課題我們開展了一系列相關工作。（1）建立了INSL6的製備體系，通過在大腸桿菌中重組表達設計的單鏈INSL6前體結合體外再摺疊與化學切割，獲得了雙鏈INSL6。（2）通過在INSL6的B-鏈N-端引入Avi-tag，利用生物素連線酶在Avi-tag上引物生物素，從而獲得了定點單生物素（biotin）標記的INSL6。（3）通過sortase催化的轉肽反應，獲得了B-鏈N-端及A-鏈N-端銪標記的INSL6。（4）2009年底報導的INSL6基因敲除小鼠研究表明INSL6與精子成熟相關，我們通過測定生精障礙病人INSL6的基因序列，從249名病人中找到一個雜合型R171H錯義突變，該突變可能影響INSL6前體的加工成熟，從而可能與人類生精障礙相關。（5）利用有標記INSL6，檢測了多種小鼠組織及多種培養細胞的膜提取物，但未發現特異性INSL6結合活力，可能由於內源INSL6受體的豐度太低。（6）將逆轉錄病毒包裝的小鼠睪丸cDNA文庫高效導入NIH3T3細胞，利用生物素標記的INSL6通過磁珠分選結合INSL6的轉染細胞，但也未能找到INSL6的受體。（7）鑒於INSL6與精子成熟相關，我們篩選了10多個在睪丸中特異性表達或高表達的孤兒G-蛋白偶聯受體，但這些孤兒受體在細胞測試中都對INSL6無反應。（8）為了解INSL6受體可能的特性，我們也在已知4個類胰島素肽受體與配基相互作用方法開展了一些工作。總之，雖然經過多種嘗試，到目前我們還未找到INSL6的受體，國內外亦無相關報導，說明該工作的難度很大。最近我們發現微螢光素酶（nanoluciferase）標記的INSL7還具有高受體結合活力，該酶標配基的檢測靈敏度比銪標記及碘-125標記配基高100倍，因此在後續工作中我們擬製備酶標INSL6並用於受體的篩選工作。
