寡聚核苷酸連結分析：寡核核苷酸，無論是DNA的或者RNA的，都有形成雙鏈結構的潛在可能性，正如下面反覆提到的，這種結構對寡核苷酸的作用有很大影響。所以，預測這種結構的穩定性對設計和最佳化寡核苷酸就很重要。在一個雙鏈結構中，鹼基對的相對穩定性是由其鄰近鹼基決定的。
基本介紹
- 中文名：寡聚核苷酸連結分析
相關資料
寡核苷酸合成的DNA（脫氧核糖核酸）可以用於鏈聚合反應，能放大確定幾乎所有DNA的片段，在這個過程中寡核苷酸是作為引物，和DNA中標的的互補片段結合，作成DNA的複製品。
按照多肽的胺基酸序列來設計PCR引物或雜交探針是最常用的實驗手段，尤其是在試圖“釣取”一個蛋白質的基因時。此時要注意的問題有：
(1)寧可用簡併引物，也不用猜測的引物。胺基酸密碼子的簡併性給予引物設計以可塑性，這比用猜測的密碼子要好得多。有人用1024個簡併引物得到很好的結果。
但是，應當避免在一個區域內有很高的簡併性。但也有簡併性低使引物不工作的報導。
(2)引物與模板的錯配。一般認為，所用引物與模板有15%～20%的錯配，PCR的效果還能接受。但是，引物3′末端的錯配比同樣錯配率的5′末端錯配會引起更嚴重的問題。
在最後4個鹼基中有2個錯配的引物，其PCR產量急劇下降。但是，當核苷酸濃度高時，3′末端有錯配的引物還能被Tag聚合酶很好地利用。在0.8mmol/L時，大多數3′末端錯配引物可以接受，雖然非專一產物比較多，DNA合成的忠實性也下降。即使在低核苷濃度下，還會有少量從錯配鹼基出發的合成，因此，在開始的PCR循環中把退火時間增加到3～5分鐘，比之於用標準退火時間和高濃度核苷酸能夠產生質量更好的所求產物。
(3)在用唯一性引物時，建議用0.2mmol/L或更低的總核苷酸濃度，因為高濃度會增加錯誤參入的比率。
(4)簡併寡核苷酸時，PCR應當在比較高的引物濃度下進行，即1～3μmol/L而不是0.2μmol/L，因為在反應混合物中的大多數寡聚物並不是被用來引發專一的反應，而只是產生高的背景而已。
按照多肽的胺基酸序列來設計PCR引物或雜交探針是最常用的實驗手段，尤其是在試圖“釣取”一個蛋白質的基因時。此時要注意的問題有：
(1)寧可用簡併引物，也不用猜測的引物。胺基酸密碼子的簡併性給予引物設計以可塑性，這比用猜測的密碼子要好得多。有人用1024個簡併引物得到很好的結果。
但是，應當避免在一個區域內有很高的簡併性。但也有簡併性低使引物不工作的報導。
(2)引物與模板的錯配。一般認為，所用引物與模板有15%～20%的錯配，PCR的效果還能接受。但是，引物3′末端的錯配比同樣錯配率的5′末端錯配會引起更嚴重的問題。
在最後4個鹼基中有2個錯配的引物，其PCR產量急劇下降。但是，當核苷酸濃度高時，3′末端有錯配的引物還能被Tag聚合酶很好地利用。在0.8mmol/L時，大多數3′末端錯配引物可以接受，雖然非專一產物比較多，DNA合成的忠實性也下降。即使在低核苷濃度下，還會有少量從錯配鹼基出發的合成，因此，在開始的PCR循環中把退火時間增加到3～5分鐘，比之於用標準退火時間和高濃度核苷酸能夠產生質量更好的所求產物。
(3)在用唯一性引物時，建議用0.2mmol/L或更低的總核苷酸濃度，因為高濃度會增加錯誤參入的比率。
(4)簡併寡核苷酸時，PCR應當在比較高的引物濃度下進行，即1～3μmol/L而不是0.2μmol/L，因為在反應混合物中的大多數寡聚物並不是被用來引發專一的反應，而只是產生高的背景而已。
